一種等離子體處理與轉(zhuǎn)基因結(jié)合的玉米育種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種等離子體處理與轉(zhuǎn)基因結(jié)合的玉米育種方法，屬于農(nóng)業(yè)育種技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米(Zea maysL.)是世界上重要的糧食、飼料作物，也是現(xiàn)代工業(yè)的重要原料。隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展及世界人口的增長，對玉米的需求量逐年攀升。據(jù)相關(guān)研究推測，到2020年世界玉米需求量將達(dá)到7.53億噸，屆時(shí)中國玉米需求量為2.14億噸，將使玉米生產(chǎn)面臨巨大挑戰(zhàn)。
[0003]但傳統(tǒng)的育種方法面臨著推廣品種單一化，育種材料遺傳基礎(chǔ)越來越狹窄，基因庫日益貧乏等問題，加之常規(guī)育種周期長，預(yù)見性差，很難使作物在產(chǎn)量、質(zhì)量和抗性方面有大的提尚。
[0004]傳統(tǒng)玉米育種在過去的幾十年確實(shí)有很大的成就，但由于育種時(shí)間過長、效率較低、品種單一化、育種材料遺傳基礎(chǔ)越來越狹窄、預(yù)見性差等局限性，導(dǎo)致低水平重復(fù)、同質(zhì)化嚴(yán)重，很難使作物在產(chǎn)量、質(zhì)量和抗性方面有大的提高。目前傳統(tǒng)玉米育種遇到很大瓶頸，甚至停滯。
[0005]利用太空特殊的環(huán)境條件對植物種子產(chǎn)生的誘變來進(jìn)行良種選育成為一種新興的育種方法，然而太空育種是人工誘變育種的一種新方法，所有人工誘變的發(fā)生均是隨機(jī)的，目前還做不到定向誘變，太空育種的成功率隨著物種的不同也會有很大差別，并且太空育種的成本相當(dāng)高，不是一般單位和個(gè)人能夠承擔(dān)的。
[0006]近年來，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展和不斷完善，采用基因工程手段進(jìn)行作物遺傳育種和新種質(zhì)的創(chuàng)造已成為可能，運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高作物產(chǎn)量的報(bào)道屢見不鮮。Dinkins等(2003)利用基因槍技術(shù)將15kDaS-玉米醇溶蛋白基因轉(zhuǎn)入大豆中，對轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行氨基酸組分分析，發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸提高了 12%?20%，半胱氨酸提高了 15%?35%，而其他的氨基酸組分沒有發(fā)生明顯的變化。丁明忠等(2000)利用花粉管通道法和減壓滲透法將大豆總DNA導(dǎo)入玉米，篩選到8個(gè)高蛋白材料，玉米種子中蛋白質(zhì)含量比對照提高20%。Zheng等(1995)將菜豆種子蛋白質(zhì)基因?qū)胨局斜磉_(dá)，使得轉(zhuǎn)基因水稻種子總蛋白含量增加4%，賴氨酸含量也有所提高。Regierer等(2002)把修飾過的質(zhì)體腺苷酸激酶基因?qū)腭R鈴薯中，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中腺苷酸水平得到明顯提高，淀粉含量增加了 60%，塊莖產(chǎn)量增加了 39%。這些研究成果，為高產(chǎn)育種技術(shù)奠定了基礎(chǔ)，也表明了隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的興起，優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的良種選育技術(shù)將步入一條快速、嶄新的道路。
[0007]農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有能夠轉(zhuǎn)移相對較大DNA片段、更有效地產(chǎn)生單位點(diǎn)整合、不易引起分子間或分子內(nèi)重排、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)，一直備受科研工作者的青睞。但是由于單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然宿主，因此人們一直認(rèn)為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法只適合于雙子葉植物和大多裸子植物的轉(zhuǎn)基因操作，以至于此方法在玉米的遺傳轉(zhuǎn)化上沒有得到過應(yīng)用。直到上世紀(jì)八十年代，經(jīng)過國內(nèi)外研究者的不懈努力，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在玉米遺傳轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用才取得了一些重要進(jìn)展。
[0008]目前并未見到將等離子體處理技術(shù)與轉(zhuǎn)基因相結(jié)合的玉米育種方法的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]針對上述現(xiàn)有技術(shù)，一種等離子體處理與轉(zhuǎn)基因結(jié)合的玉米育種方法
[0010]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0011]—種等離子體處理與轉(zhuǎn)基因結(jié)合的玉米育種方法，步驟如下:
[0012](1)將玉米品種的種子進(jìn)行冷等離子體處理:將玉米品種的父母本種子置于冷等離子體處理機(jī)內(nèi)，在140W的處理功率下對玉米種子進(jìn)行18秒的非電離幅射處理，處理以氦氣為工作介質(zhì)，在真空封閉環(huán)境中進(jìn)行；
[0013]所述玉米品種選自魯種99118號、DH4866、齊319等；
[0014](2)上述處理后的玉米種子，用70%乙醇(體積濃度)浸泡30?45s，用無菌水洗1?2次，而后用0.1 %的HgCl2溶液(質(zhì)量濃度)浸泡8?lOmin，再用無菌水沖洗4?5次，用濾紙吸干表面殘留液體后，接種于不含抗生素的MS發(fā)芽培養(yǎng)基上，26土 1°C暗培養(yǎng)1?2天，待種子萌動(露白)后，將其放在改良MS培養(yǎng)基上于黑暗條件下萌發(fā)；待胚芽伸長止3?4厘米時(shí)，剝離胚芽鞘及2?3片幼葉，露出莖尖頂端生長錐；
[0015](3)利用基因重組技術(shù)，將目的基因?qū)肟瞻谆A(chǔ)載體構(gòu)建重組載體；所得重組載體經(jīng)三親雜交法將目的基因轉(zhuǎn)移至農(nóng)桿菌，挑取單菌落，進(jìn)行PCR鑒定得到目標(biāo)農(nóng)桿菌；
[0016]所述目的基因可以是ZmPINla基因、ZmPINlb基因或精氨酸酶基因ZmArg ;
[0017](4)目標(biāo)農(nóng)桿菌的活化與重懸:用無菌牙簽從平板上挑取目標(biāo)農(nóng)桿菌單菌落接種至20ml附加抗生素(50mg/L的利福平)的pH為7.0的LB液體培養(yǎng)基上，28°C，180r/min培養(yǎng)至0D6M= 0.6?0.8 ;取菌液加至相同培養(yǎng)基上，28°C，180r/min繼續(xù)培養(yǎng)5?6小時(shí)，培養(yǎng)至菌液濃度0D6QQ= 0.5?0.6 ；5000r/min, 4°C離心5min，收集菌體，去上清，用液體MS培養(yǎng)基重懸菌體，而后5000r/min，4°C離心5min，收集菌體，再次用液體MS培養(yǎng)基重懸菌體，而后5000r/min, 4°C離心5min，收集菌體，用MS培養(yǎng)基重懸菌體后，即可以用于轉(zhuǎn)化，備用；
[0018](5)將活化了的農(nóng)桿菌菌液倒在4.5厘米直徑的培養(yǎng)皿中，傾斜培養(yǎng)皿，使露出莖尖生長錐的無菌苗浸泡在菌液中，在0.5 X105Pa大氣壓下處理10分鐘；浸染后的芽尖用無菌濾紙吸干，萌發(fā)種子放在改良MS培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)2?3天，培養(yǎng)溫度為22?24°C;然后將無菌苗放在散射光下培養(yǎng)2天；將照光培養(yǎng)后的無菌苗移栽到裝有滅菌蛭石的營養(yǎng)缽中，然后讓植株在自然光照下生長，日溫22?28°C，夜溫15?21 °C，隔天澆灌1/2改良MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽；
[0019](6)在轉(zhuǎn)化苗長到3?4葉期時(shí)，均勻噴灑合適濃度的草甘膦水溶液行篩選，存活植株長到5?6葉期時(shí)移栽到田間收獲目標(biāo)玉米種。
[0020]本發(fā)明的等離子體處理與轉(zhuǎn)基因結(jié)合的玉米育種方法，將等離子體處理技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合，綜合了兩種技術(shù)的優(yōu)勢，可以培育出性能更加優(yōu)異的玉米新品種。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0021](1)利用冷等離子技術(shù)處理種子能夠激發(fā)種子活力，實(shí)現(xiàn)促長、抗逆效果，育成的玉米種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率增加，抗逆性增強(qiáng)，高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、廣適、優(yōu)質(zhì)、適于密植和機(jī)械化作業(yè)。
[0022](2)冷等離子體處理功率人為可控，通過反復(fù)試驗(yàn)可以找到某種玉米種子某一特定性狀的處理功率，能更好地滿足選育玉米優(yōu)良品種的需求，克服了傳統(tǒng)的育種手段時(shí)間長、目標(biāo)盲目性、育種質(zhì)量低、育種成本高的弊端，在玉米育種手段上具有創(chuàng)新性。
[0023](3)將外源目的基因轉(zhuǎn)入玉米中，可成功表達(dá)，從而使得玉米具備耐旱、抗倒伏等優(yōu)異特性，對玉米的產(chǎn)量性狀也有相應(yīng)的增加。
[0024](4)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)，操作簡單，整個(gè)工作周期短，可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得轉(zhuǎn)基因植株。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0026]實(shí)施例1等離子體處理與轉(zhuǎn)基因結(jié)合進(jìn)行玉米育種
[0027]步驟如下:
[0028](1)將玉米品種(DH4866)的種子進(jìn)行冷等離