食源性致病微生物檢測的擴增引物和液相芯片試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的是涉及食源性致病微生物檢測的擴增引物和 液相芯片試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 致病微生物污染是餐飲服務(wù)環(huán)節(jié)加工制作過程中產(chǎn)生食品安全風(fēng)險的主要來源 之一，從食品原料、加工過程、餐飲具各環(huán)節(jié)均有可能帶入致病微生物污染餐飲食品，增加 食品安全風(fēng)險。常見的致病菌有：阪崎腸桿菌、單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌、大腸埃希氏菌 0157、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌等。
[0003] 食源性致病微生物的檢測技術(shù)是食源性疾病的預(yù)防與控制的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。目 前，檢測食品中食源性致病微生物的方法有傳統(tǒng)方法（國家標(biāo)準(zhǔn)GT4789)、基于核酸為基礎(chǔ) 的方法（實時熒光PCR、普通PCR方法和環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法）和免疫學(xué)方法（如酶聯(lián)免疫 吸附法（ELISA)、免疫膠體金法）。傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定主要依靠細(xì)菌培養(yǎng)、血清學(xué)、生物化學(xué)及 細(xì)菌形態(tài)學(xué)等方法進行分類鑒定，傳統(tǒng)方法雖然準(zhǔn)確、全面，但檢測周期長、程序復(fù)雜、所需 試劑繁多，實際檢測工作量巨大；免疫膠體金是應(yīng)用較為普遍的方法之一，但其特異性及靈 敏度較低；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)技術(shù)要求低，攜帶方便，常以試劑盒的形式出現(xiàn)且易商 品化，是目前應(yīng)用最為廣泛和成熟的技術(shù)，但該方法需要高質(zhì)量抗體，檢測成本大且操作過 程繁瑣；普通PCR方法和熒光定量PCR由于檢測通量的局限性，一次反應(yīng)只可以檢測一個指 標(biāo)，不能滿足實際需求。
[0004] 此外，也有現(xiàn)有技術(shù)公開用剿式PCR結(jié)合熒光微球信號進行檢測，該方法很大程 度上提高了檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度。但該方法依然比較復(fù)雜，且因食源性致病微生物檢測 的復(fù)雜性，檢測方法的靈敏度還需要提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于此，本發(fā)明的目的之一是提供一種特異性強、靈敏度高和檢測方法簡單的食 源性致病微生物檢測液相芯片試劑盒，用于單獨或者任意組合檢測阪崎腸桿菌、單核細(xì)胞 增生性李斯特氏菌，大腸埃希氏菌0157,金黃色葡萄球菌，志賀氏菌，沙門氏菌、副溶血性弧 菌。
[0006] 實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0007] -種食源性致病微生物檢測液相芯片試劑盒，包括有：
[0008] (A)針對待檢測微生物基因設(shè)計的擴增引物對，每對擴增引物包括有擴增引物F1 和擴增引物R1，所述擴增引物F1從5'端至3'端依次由tag序列，間隔臂，每種相應(yīng)待檢 測微生物的正向引物組成，所述擴增引物R1為5'端帶有生物素標(biāo)記的、對應(yīng)待檢測微生物 的反向引物；所述tag序列選自SEQ ID NO. 17-SEQ ID N0. 28 ;所述間隔臂選自C3Spacer、 Spacer9、dSpacer、3，C6Spacer、Spacerl2、Spacerl8 或 PC Spacer 中的任一種；所述待檢 測微生物的正向引物和反向引物包括有以下至少一對：針對阪崎腸桿菌的SEQ ID NO. 1和 SEQ ID NO. 2、針對單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌的SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4、針對大腸埃 希氏菌0157的SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6、針對金黃色葡萄球菌的SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8、針對志賀氏菌的SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10、針對沙門氏菌SEQ ID NO. 11和 SEQ ID NO. 12、針對副溶血性弧菌的 SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 ;
[0009] (B)包被有Anti-tag序列的磁珠，所述Anti-tag序列與相應(yīng)的待檢測微生物的 tag序列互補配對，所述Anti-tag序列選自SEQ ID NO. 29-SEQ ID NO. 40;針對不同待檢測 微生物的磁珠具有不同的熒光編碼。
[0010] 在其中一個實施例中，所述待檢測微生物的正向引物和反向引物還包括有針對內(nèi) 控細(xì)菌的 SEQ ID Να 15 和 SEQ ID Να 16。
[0011] 在其中一個實施例中，所述間隔臂為C3SpaCer。
[0012] 在其中一個實施例中，所述tag序列為：針對阪崎腸桿菌的SEQ ID NO. 17、針對單 核細(xì)胞增生性李斯特氏菌的SEQ ID NO. 18、針對大腸埃希氏菌0157的SEQ ID NO. 19、針 對金黃色葡萄球菌的SEQ ID NO. 20、針對志賀氏菌的SEQ ID NO. 21、針對沙門氏菌SEQ ID NO. 22、針對副溶血性弧菌的SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 23。
[0013] 在其中一個實施例中，針對內(nèi)控細(xì)菌的tag序列為SEQ ID NO. 24。
[0014] 在其中一個實施例中，所述磁珠和Anti-tag序列之間還設(shè)有間隔臂序列；進一步 地，所述間隔臂序列優(yōu)選為5 - 10個T。
[0015] 本發(fā)明的另一目的是提供一種食源性致病微生物檢測的擴增引物。
[0016] 實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0017] 食源性致病微生物檢測的擴增引物，包括有以下至少一對：針對阪崎腸桿菌的SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2、針對單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌的SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4、 針對大腸埃希氏菌0157的SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6、針對金黃色葡萄球菌的SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8、針對志賀氏菌的SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10、針對沙門氏菌SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12、針對副溶血性弧菌的 SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14。
[0018] 在其中一個實施例中，還包括有針對細(xì)菌內(nèi)控序列的SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 16 〇
[0019] 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：
[0020] 1.本發(fā)明所設(shè)計的七種食源性致病微生物檢測液相芯片具有非常好的信號-噪 聲比，能夠在均一的反應(yīng)條件下進行雜交反應(yīng)，所設(shè)計的擴增引物與tag序列之間不形成 發(fā)夾結(jié)構(gòu)、回文結(jié)構(gòu)、不存在特異性結(jié)合，anti-tag序列、tag序列以及擴增產(chǎn)物之間不存 在交叉反應(yīng)，同時，多種標(biāo)簽序列和擴增引物的組合使用本發(fā)明形成一個檢測效果完好的 系統(tǒng)，從而實現(xiàn)多種致病微生物目標(biāo)基因的并行檢測。本發(fā)明所提供的檢測方法與國標(biāo)法 的吻合率高達(dá)1〇〇%。
[0021] 2.本發(fā)明設(shè)計的擴增引物具有非常好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分和特異性擴增各種目 標(biāo)檢測致病微生物相應(yīng)的基因片段，并通過tag序列與anti-tag序列的特異性結(jié)合，實現(xiàn) 七種致病微生物擴增產(chǎn)物的準(zhǔn)確區(qū)分，而且，本發(fā)明設(shè)計的檢測試劑盒，其靈敏度得到極大 提高，從實驗結(jié)果可知，七種食源性致病微生物的檢測靈敏度可達(dá)10CFU/mL。
[0022] 3.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，一步多重PCR即可完成多達(dá)七種目標(biāo)微生物中相 關(guān)基因目標(biāo)序列的擴增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素， 因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的定性分析特征。
[0023] 4.本發(fā)明所提供的檢測方法所需要的時間是4~5小時，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)推薦 的檢測方法，特別符合實際檢測需要。
【具體實施方式】
[0024] 為了便于理解本發(fā)明，下面通過具體實施例對本發(fā)明進行更全面的描述。本發(fā)明 可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例 的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。下列實施例中未注明具體條件的 實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。 實施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。
[0025] 除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域 的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實 施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語"和/或"包括一個或多個相關(guān)的所 列項目的任意的和所有的組合。
[0026] 實施例1
[0027] 本實施例所述食源性致病微生物檢測液相芯片試劑盒，主要包括有：
[0028] 一、PCR 引物
[0029] 針對阪崎腸桿菌的rpsU-dnaG基因、單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌的prfA基因，大 腸埃希氏菌0157的flic基因，金黃色葡萄球菌的Sa442基因，志賀氏菌的ipaH基因，沙門 氏菌的fim基因、副溶血性弧菌的toxR基因、細(xì)菌內(nèi)控序列16S-rRNA，分別設(shè)計擴增引物對。
[0030] 其中，擴增引物F1由三部分組成，5'端至3'端依次是：tag序列，間隔臂，相應(yīng)基 因的正向擴增引物，同時，擴增引物R1為5'端帶上生物素標(biāo)記的、對應(yīng)的待檢測微生物的 反向引物，引物序列如下表所示：
[0031] 表1食源性致病微生物基因及擴增引物
[0032]
[0036] 關(guān)于間隔臂：
[0037] 本發(fā)明的擴增引物F1由三部分組成，5'端至3'端依次是：tag序列，間隔臂，相應(yīng) 基因的正向擴增引物。
[0038] 本發(fā)明中，在Tag序列和正向擴增引物間插入一段間隔臂，間隔臂可以連接兩段 堿基序列（tag序列和正向擴增引物），但不能與脫氧核糖核苷酸堿基配對，在PCR擴增過程 中，該間隔臂可以阻止DNA聚合反應(yīng)向前進行，從而使PCR產(chǎn)物不帶有與tag序列互補配對 的anti-tag序列，大大提高雜交效率和檢測信號的強度。
[0039] 所述間隔臂可以選自：C3Spacer、Spacer9、dSpacer、3' C6Spacer、Spacerl2、 Spacerl8或PC Spacer中的一種，本實施例間隔臂優(yōu)選為C3Spacer。
[0040] 所有PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。合成后的每條引物分 別用 10mmol/L Tris Buffer 配制成 50umol/mL 的 1C存液。
[0041] 二、Anti-tag序列包被的磁珠
[0