SSCP-HD技術進行基因分型。
[0042] 下面結合實例來對本發(fā)明作進一步說明：
[0043] 實例一：
[0044] 1、樣品準備：朱鹮血液和組織樣品來自德清、佐渡、北京、河南、洋縣和樓觀臺等人 工種群。
[0045] 2、DNA提取：酚氯仿法提取血液和組織DNA。
[0046] 3、引物合成：根據已得的朱鹮MHC基因序列設計位點通用引物擴增外顯子2,用于 UAA位點的分型，華大基因合成引物。引物序列如下表：
[0047]
[0048] 4、引物擴增：將上述擴增引物分別應用于PCR，擴增所提取的樣品DNA。設置PCR 熱循環(huán)退火溫度范圍為61°C。
[0049] 5、擴增結果檢測：取2ul上述PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，膠濃度為 1.5%。結果如圖1所示，此引物可以有效擴增目的條帶，目的條帶的片段大小均處于 310bp，可用于后續(xù)的SSCP-HD實驗從而進行基因分型。
[0050] 6、引物擴增體系：5ul 2XGC buffer I，0· 8ul dNTP(2. 5Mm)，0· 3ul 上游引物 (10uM)，0.3ul 下游引物（10uM)，lul gDNA，0. lul Ex-Taq(5U/ul)，2.5ul 雙蒸水。體系總體 積 10ul〇
[0051] 7、引物擴增條件：
[0053] 8、在上述的PCR擴增產物基礎上，利用SSCP-HD技術進行基因分型，步驟如下：
[0054] (1)用玻璃洗滌劑清洗大小玻璃板，瀝水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精揮發(fā)后裝 板，將間隔條置于大小玻璃板間，并用專用架將兩邊夾緊，固定于模具上；
[0055] (2)制備12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠膠液，將膠液混勻后慢慢注入大小玻璃板 間，確認無氣泡存在后插入梳子，常溫平置；
[0056] (3)待膠凝固后，從模具上卸下并架于電泳裝置上，用瓊脂糖封膠；取下梳子，并 用裝滿0. 5XTBE的注射器沖洗點樣孔；放入電泳槽中，倒入0. 5XTBE，預電泳20min ;
[0057] (4)樣品電泳，吸取8uL PCR產物，加入4uL 2 X loading buffer，快速離心混合， 95°C變性7min后迅速置于冰上，并用槍及時加入點樣孔內，4°C，30W，電泳8-llh ;
[0058] (5)將膠從玻璃板間卸下，加入500mL固定液，于搖床上固定30min，倒掉固定液， 倒入500mL雙蒸水洗膠4次；
[0059] (6)加入500mL銀染液，于搖床上銀染30min，倒掉銀染液，使用500mL雙蒸水迅速 洗膠4次；
[0060] (7)加入500mL預冷的顯影液，于搖床顯影，等待條帶清晰后倒去顯影液，加入 500mL固定液終止顯影，倒掉固定液，倒入500mL雙蒸水洗膠4次。
[0061] (8)讀取條帶，如圖3所示，共有三種帶型，分別為aa，cc和ac。
[0062] 實例二：
[0063] 1.樣品準備：朱鹮血液和組織樣品來自德清、佐渡、北京、河南、洋縣和樓觀臺等 人工種群。
[0064] 2. DNA提?。核釟夥路ㄌ崛⊙汉徒M織DNA。
[0065] 3.引物合成：根據已得的朱鹮MHC基因序列設計UBA位點外顯子3的特異性引物， 華大基因合成引物。引物序列如下表：
[0067] 4.弓丨物擴增：將上述擴增引物分別應用于PCR，擴增所提取的樣品DNA。設置PCR 熱循環(huán)退火溫度范圍為61°C。
[0068] 5.擴增結果檢測：取2ul上述PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，膠濃度為 1.5%。結果如圖2所示，此引物可以有效擴增目的條帶，目的條帶的片段大小均處于 150bp，將此PCR產物送交華大測序，根據測序結果得出基因型。
[0069] 6.引物擴增體系：5ul 2XGC buffer I，0.8ul dNTP(2.5Mm)，0.3ul 上游引物 (10uM)，0.3ul 下游引物（10uM)，lul gDNA，0. lul Ex-Taq(5U/ul)，2.5ul 雙蒸水。體系總體 積 10ul〇
[0070] 7.引物擴增條件：
[0072] 8.在上述的PCR擴增產物基礎上，利用SSCP-HD技術進行基因分型，步驟如下：
[0073] (1)用玻璃洗滌劑清洗大小玻璃板，瀝水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精揮發(fā)后裝 板，將間隔條置于大小玻璃板間，并用專用架將兩邊夾緊，固定于模具上；
[0074] (2)制備12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠膠液，將膠液混勻后慢慢注入大小玻璃板 間，確認無氣泡存在后插入梳子，常溫平置；
[0075] (3)待膠凝固后，從模具上卸下并架于電泳裝置上，用瓊脂糖封膠；取下梳子，并 用裝滿0. 5XTBE的注射器沖洗點樣孔；放入電泳槽中，倒入0. 5XTBE，預電泳20min ;
[0076] (4)樣品電泳，吸取8uL PCR產物，加入4uL 2 X loading buffer，快速離心混合， 95°C變性7min后迅速置于冰上，并用槍及時加入點樣孔內，4°C，30W，電泳8-llh ;
[0077] (5)將膠從玻璃板間卸下，加入500mL固定液，于搖床上固定30min，倒掉固定液， 倒入500mL雙蒸水洗膠4次；
[0078] (6)加入500mL銀染液，于搖床上銀染30min，倒掉銀染液，使用500mL雙蒸水迅速 洗膠4次；
[0079] (7)加入500mL預冷的顯影液，于搖床顯影，等待條帶清晰后倒去顯影液，加入 500mL固定液終止顯影，倒掉固定液，倒入500mL雙蒸水洗膠4次。
[0080] (8)讀取條帶，如圖4所示，共有三種帶型。
【主權項】
1. 用于朱鶏I類血1C基因序列擴增的引物組，其特征在于，引物組包含5對引物，引物 對的引物序列如下： 引物對一：上游引物如SEQIDNO. 1所示； 下游引物如SEQIDNO. 2所示； 引物對二：上游引物如SEQIDNO. 3所示； 下游引物如SEQIDNO. 4所示； 引物對Ξ:上游引物如SEQIDNO. 5所示； 下游引物如SEQIDNO. 6所示； 引物對四：上游引物如SEQIDNO. 7所示； 下游引物如SEQIDNO. 8所示； 引物對五：上游引物如SEQIDNO. 9所示； 下游引物如SEQIDNO. 10所示。2. -種朱鶏I類MHC基因分型方法，其特征在于采用權利要求1所述的引物對進行 PCR擴增，每對引物均在lOuLPCR體系中，并在特定的PCR擴增條件下進行目標片段擴增， 然后運用SSCP分型方法進行基因分型。3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述的lOuLPCR體系是： 2XGC化fferl 自孤 濃度為2. 5抽1的出NTP 化8姐， 濃度為lOuM的上雜引物 化細L 濃度為lOuM的下游引物 0. 3址 曲纖 1址 濃度為甜/uL的Ex-Taq 日.1化 雙蒸水 2.自址 〇·4. 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述的特定的PCR擴增條件是：1) 95°C預變 性5分鐘；2) 95°C變性30秒；3)在退火溫度下下退火；4) 72°C復性30秒；5)重復步驟2)至 步驟4)32次；6)72°C延伸5分鐘；其中不同引物對使用的退火溫度和退火時間不同，第一 對引物的退火溫度為ere,退火時間為30秒；第二對引物的退火溫度為67°C，退火時間為 30秒；第Ξ對引物的退火溫度為60°C，退火時間為25秒；第四對引物的退火溫度為ere， 退火時間為20秒；第五對引物的退火溫度為60°C，退火時間為25秒。5. 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述的SSCP分型方法中，固定后、銀染后W及 顯色后應分別使用雙蒸水洗膠4次，W獲得清晰的SSCP條帶。6. 如權利要求2或5所述的方法，其特征在于所述的SSCP分型方法是： 1) 用玻璃洗涂劑清洗大小玻璃板，漸水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精揮發(fā)后裝板，將 間隔條置于大小玻璃板間，并用專用架將兩邊夾緊，固定于模具上； 2) 制備12%的非變性聚丙締酷胺凝膠膠液，將膠液混勻后慢慢注入大小玻璃板間，確 認無氣泡存在后插入梳子，常溫平置； 3) 待膠凝固后，從模具上卸下并架于電泳裝置上，用瓊脂糖封膠；取下梳子，并用裝滿 0. 5XTBE的注射器沖洗點樣孔；放入電泳槽中，倒入0. 5XTBE，預電泳20min; 4) 樣品電泳，吸取8uLPCR產物，加入4uL2Xloadingbuffer,快速離屯、混合，95°C變 性7min后迅速置于冰上，并用槍及時加入點樣孔內，4°C，30W，電泳8-1比； 5) 將膠從玻璃板間卸下，加入500mL固定液，于搖床上固定30min，倒掉固定液，倒入 500mL雙蒸水洗膠4次； 6) 加入500血銀染液，于搖床上銀染30min，倒掉銀染液，使用500血雙蒸水迅速洗膠 4次； 7) 加入500M^預冷的顯影液，于搖床顯影，等待條帶清晰后倒去顯影液，加入500M^固 定液終止顯影，倒掉固定液，倒入500mL雙蒸水洗膠4次； 8) 讀取條帶，確定基因型。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一套用于擴增朱鹮MHC？Ⅰ類基因經典座位序列的引物及基因分型方法，其序列如SEQ？ID？NO.1～SEQ？ID？NO.10所示。采用本發(fā)明的擴增引物，可以有效擴增出朱鹮Ⅰ類MHC各經典座位的核苷酸序列，并通過后續(xù)的SSCP-HD或測序技術對每個個體進行基因分型。本發(fā)明具有特異性強、操作過程簡便快速的優(yōu)點，通過對朱鹮Ⅰ類MHC基因經典座位進行分型，可以評估朱鹮個體Ⅰ類MHC基因經典座位的多態(tài)性高低，檢測其抵抗病毒性疾病的潛力，為朱鹮保護工作中的新種群奠基者選擇、野化放歸個體選擇以及人工配對等工作提供重要參考。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105316408
【申請?zhí)枴緾N201510737947
【發(fā)明人】方盛國, 萬秋紅, 藍泓
【申請人】浙江大學
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2015年11月3日
【公告號】CN105316408B