一種鑒定或輔助鑒定豬達100kg體重日齡的方法及其專用試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及一種鑒定或輔助鑒定豬達100kg體重日齡的 方法及其專用試劑盒。
【背景技術】
[0002] 豬為六畜之首，養(yǎng)豬業(yè)在世界尤其是中國國民經(jīng)濟中占有重要地位。豬肉在諸多 肉類產品中的比重一直保持在三分之一左右，是人們比較喜愛的副食之一。人們的生活不 斷改善，傳統(tǒng)的養(yǎng)殖技術已經(jīng)不能滿足人們對豬肉的需求量。隨著現(xiàn)代育種技術的發(fā)展，豬 的生產性能顯著提高，豬的健康養(yǎng)殖和育肥就顯得格外重要。
[0003] 豬達100kg體重日齡是評估豬生長速度的重要指標，可以間接反映飼料利用率。 大量數(shù)據(jù)表明豬達l〇〇kg體重日齡的縮短，生長速度越快，可以減少豬場的生產成本，豬場 經(jīng)濟效應會明顯提高。遺傳力是數(shù)量性狀的重要參數(shù)，根據(jù)遺傳力的大小，可以預測遺傳進 展，個體育種值。因此，如何有效的提高豬生長速度，縮短達100kg體重日齡，并提前做出判 斷，是每個豬場經(jīng)營者及育種學家追求的目標。
[0004] 近十年來，分子生物技術的發(fā)展為豬的育種提供了一種基于DNA變異的新型遺傳 標記。特別是分子標記輔助選擇技術的出現(xiàn)，為顯著改善豬的這些數(shù)量性狀提供可能。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定豬達100kg體重日齡性狀的方法。
[0006] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定豬達100kg體重日齡性狀的方法是檢測豬個體的 H19基因的第402位脫氧核糖核苷酸是T還是C還是T和C，以確定豬個體的基因型是TT基 因型還是CC基因型還是TC基因型，根據(jù)所述豬個體的基因型確定所述豬個體達100kg體 重日齡大?。篢T基因型的豬個體達100kg體重日齡多于CC基因型的豬個體，CC基因型的豬 個體達100kg體重日齡多于TC基因型的豬個體；
[0007] 所述CC基因型為H19基因自5'末端第402位脫氧核糖核苷酸為C的純合體；
[0008] 所述TC基因型為H19基因自5'末端第402位脫氧核糖核苷酸為T和C的雜合 體；
[0009] 所述TT基因型為H19基因自5'末端第402位脫氧核糖核苷酸為T的純合體；
[0010] 所述H19基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
[0011] 上述方法中，所述檢測豬個體的H19基因的第402位脫氧核糖核苷酸是T還是C 還是T和C的方法為如下A)或B):
[0012] A)直接測序；
[0013] B)用能夠擴增含有豬H19基因的第402位脫氧核糖核苷酸的引物對擴增所述待測 豬的基因組DNA，得到PCR擴增產物，如果PCR擴增產物自5'末端起第402位的堿基均為 C，則所述豬的基因型為CC基因型，如果PCR擴增產物自5'末端起第402位的堿基為T和 C，則所述豬的基因型為AG基因型，如果PCR擴增產物自5'末端起第118位的堿基均為T， 則所述豬的基因型為ΤΤ基因型。
[0014] 上述方法中，所述Β)包括如下步驟：所述擴增所用的引物對滿足如下條件：以所 述豬個體的基因組DNA為模板進行PCR擴增的產物含有Η19基因的第402位脫氧核糖核苷 酸；
[0015] 所述引物對為由序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所示的單 鏈DNA分子組成的引物對。
[0016] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定豬達100kg體重日齡的試劑。
[0017] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定豬達100kg體重日齡的試劑是檢測豬個體的H19基 因的的第402位脫氧核糖核苷酸是T還是C還是T和C的物質；
[0018] 所述H19基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
[0019] 上述試劑中，所述物質為由序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列 3所示的單鏈DNA分子組成的引物對。
[0020] 本發(fā)明還有一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定豬達100kg體重日齡的試劑盒。
[0021] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定豬達100kg體重日齡的試劑盒含有上述試劑。
[0022] 上述試劑或上述試劑盒在鑒定或輔助鑒定豬個體達100kg體重日齡中的應用也 屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0023] 上述試劑或上述試劑盒在制備鑒定或輔助鑒定豬個體達100kg體重日齡的產品 中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0024] 上述方法或上述試劑或上述試劑盒在豬育種中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0025] 上述方法或上述試劑或上述試劑盒在選育生長速度快和/或豬達100kg體重日齡 短的種豬中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0026] 本發(fā)明的最后一個目的是提供一種選育生長速度快和/或豬達100kg體重日齡短 的種豬的方法。
[0027] 本發(fā)明提供的選育生長速度快和/或豬達100kg體重日齡短的種豬的方法包括選 擇TC基因型的豬進行育種；所述TC基因型為H19基因的第402位脫氧核糖核苷酸為TC的 雜合體；
[0028] 所述H19基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
[0029] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了豬H19基因的第一外顯子的T402C位點對豬達100kg體重日齡有顯 著影響，并基于該SNP位點提供了一種鑒定或輔助鑒定豬達100kg體重日齡的方法：基因型 為TT的豬個體達100kg體重日齡多于CC基因型的豬個體，CC基因型的豬個體達100kg體 重日齡多于TC基因型豬個體。通過試驗證明：本發(fā)明用H19基因的第402位單核苷酸多態(tài) 性鑒定豬達l〇〇kg體重日齡的方法與豬達100kg體重日齡的實際測定結果一致，對選擇優(yōu) 良豬種有重要意義。
【具體實施方式】
[0030] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0031] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032] 下述實施例中的豬達100kg體重日齡為自豬出生日起至豬體重達到100kg的時 間。
[0033] 實施例1、一種輔助鑒定豬達100kg體重日齡的方法
[0034] -、豬H19基因的SNP位點的篩選
[0035] 1、豬耳組織樣品DNA的提取
[0036] 分別采集來自河北豬場的32頭長白豬的血液樣品，樣品采集后，保存于75%酒精 中，并于-20°C保存。采用苯酚-氯仿抽提法提取血液樣品的基因組DNA，具體步驟如下：
[0037] (1)耳組織樣的準備：剪取大小適中的耳組織樣，用生理鹽水沖洗掉表面的雜質 和血污，放于1. 5ml離心管中，用眼科剪剪碎，并向其中加入500uL的組織裂解液（北京百 泰科生物技術有限公司；產品編號：AU19011);
[0038] (2)根據(jù)所剪取的耳組織樣的大小，向離心管中加入15~25uL的蛋白酶 K(SIGMA-ALDRICH;產品編號：SRE0005);
[0039] (3)放于水浴搖床上，55°C消化過夜，確保耳組織樣消化完全，得到消化徹底的耳 組織；
[0040] (4)將上述消化徹底的耳組織樣于室溫放置，加入等體積的Tris-飽和酚（江蘇寶 萊生物科技有限公司），翻覆顛倒混勾5min ;
[0041] (5) 14000rpm/min離心10min，離心管中會出現(xiàn)分層現(xiàn)象，上層為含有核酸的水 相，下層為含有其他雜質的有機相。
[0042] (6)利用微量移液器小心吸取上層含核酸的水相，放置于一個新的1. 5ml離心管 中（為了避免吸起下層的有機相，最好用去除尖頭的藍槍頭），棄下層有機相；
[0043] (7)重復步驟⑷~（6);
[0044] (8)向含有水相的離心管中加入等體積的飽和酚：氯仿=1 :1，反復顛倒混勻 5min，14000rpm/min離心10min，然后吸取上層液體，放于一個新的1. 5mL離心管中；
[0045] (9)重復步驟（8);
[0046] (10)向其中加入飽和酚：氯仿：異戊醇的體積比為25 :24 :1，翻覆顛倒混勻， 14000rpm/min 離心 lOmin ;
[0047] (11)吸除上層液體，加入2倍體積的無水乙醇（事先放于_20°C冰箱內預冷）沉 淀DNA，此時會在離心管內出現(xiàn)絲狀或絮狀DNA沉淀；
[0048] (12)用黃色槍頭小心的挑出絲狀或絮狀DNA沉淀，放于一個新的1. 5mL的EP管， 向其中加入70%乙醇（_20°C預冷）500uL，洗滌DNA沉淀，溫和顛倒30s，棄70%乙醇；
[0049] (13)重復步驟（12);
[0050] (14)將含有DNA沉淀的離心管放于室溫環(huán)境中，干燥20~30min ;
[0051] (15)加入60~80uL的TE緩沖液或雙蒸水溶解DNA沉淀（勿劇烈振蕩或離心）， 將其保存于-20 °C冰箱內。
[0052] 2、目的片段的擴增及測序
[0053] (l)PCR 擴增
[0054] 以步驟1獲得的基因組DNA為模板，采用上游引物：TGCCCAACCTGAGCCCTGAC (序列 2)和下游引物：TCCCACCAGACTCGCTTGA(序列3)進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0055] PCR 擴增體系：10XLA PCR Buffer 2ul，10mM dNTP Mix 1.6ul，上下游引物 (lOpmol/L)各 lul，LA Taq DNA 聚合酶（5U/ul)，基因組 DNA lul，ddH20 13.2ul。
[0056] PCR 反應程序：94°C預變性，5min ;94°C變性，30s，58°C 退火，30s，72°C延伸，30s， 72°C延伸，lOmin。
[0057] (2) PCR產物的回收純化
[0058] 利用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（北京百泰