一種可同時(shí)檢測(cè)果汁飲料中四種污染菌的基因快速篩查方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于果汁飲料中污染菌檢測(cè)方法，特別是一種基于多重PCR技術(shù)以及毛細(xì) 管電泳分離技術(shù)，涉及一種可同時(shí)檢測(cè)果汁飲料中四種污染菌的基因快速篩查方法，用于 幾種常見(jiàn)果汁飲料中污染菌的基因快速篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 果汁是人們生活中喜愛(ài)的液體飲料之一，是以水果為原料經(jīng)過(guò)物理方法如壓榨、 離心、萃取等得到的汁液產(chǎn)品。果汁飲料，尤其是純果汁里富含身體必需的維生素和微量元 素。隨著消費(fèi)者的健康意識(shí)增強(qiáng)，果汁飲料的消費(fèi)量日益增加。
[0003] 果汁飲料生產(chǎn)加工過(guò)程中可能會(huì)污染一些病原微生物，在運(yùn)輸和儲(chǔ)存中，暴露于 非冷藏環(huán)境會(huì)加劇污染菌的增殖，從而造成異味物質(zhì)和引起果汁飲料渾濁，從而引起果汁 飲料變質(zhì)，危害消費(fèi)者的健康。如何能夠快速、有效的檢測(cè)果汁飲料中是否存在污染菌成為 本領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。
[0004] 對(duì)于果汁飲料中微生物的檢測(cè)方式主要分為兩類(lèi)，第一類(lèi)是基于培養(yǎng)基的傳統(tǒng)培 養(yǎng)法，國(guó)內(nèi)外大多數(shù)果汁飲料廠(chǎng)采用此類(lèi)方法，但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，且只能定量不能定性到種 屬，因此無(wú)法及時(shí)指導(dǎo)生產(chǎn)技術(shù)人員對(duì)果汁飲料生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控；第二類(lèi)是基于PCR技 術(shù)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，PCR技術(shù)從核酸、基因水平極大地提高了檢測(cè)效率及靈敏度，能 夠定性到種、屬或一類(lèi)目標(biāo)菌，檢測(cè)快速且定性能力強(qiáng)，因此無(wú)論對(duì)于成品果汁飲料質(zhì)量的 監(jiān)控，或者生產(chǎn)過(guò)程問(wèn)題的溯源排查，PCR技術(shù)的應(yīng)用都具有廣闊的前景和深遠(yuǎn)的意義，但 一次反應(yīng)只能檢測(cè)一類(lèi)微生物。
[0005] 大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，幾種果汁飲料污染菌桔青霉Penicillium citrinum、釀酒酵母 Saccharomyces cereviseae、酉孝母菌Dekera naardenensis、黑曲霉Aspergillus niger，可 經(jīng)受果汁巴氏殺菌過(guò)程而存活，從而對(duì)高溫消毒處理后的果汁仍能造成危害。這幾種污染 菌的鑒別是一項(xiàng)較復(fù)雜的工作，這些微生物需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)孵育時(shí)間，檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，因而 有必要進(jìn)行更快速的檢測(cè)方法。但目前檢測(cè)方法多為培養(yǎng)基的傳統(tǒng)培養(yǎng)法，或者使用單重 PCR對(duì)每個(gè)有害菌進(jìn)行逐一檢測(cè)，檢測(cè)成本高、耗時(shí)費(fèi)力，且不能一次反應(yīng)得出檢測(cè)結(jié)果，不 利于大量樣品的快速檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，克服果汁飲料中幾種污染菌檢測(cè)技術(shù)操作 繁瑣，費(fèi)時(shí)耗力等不足，提供一種由4對(duì)引物組成的引物體系，通過(guò)采用高通量的多重PCR 技術(shù)與高分辨率的毛細(xì)管電泳分離技術(shù)相結(jié)合的方式，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)果汁飲料中是否存在污 染菌污染的檢測(cè)。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明針對(duì)4種污染菌對(duì)樣品進(jìn)行分析，若能檢測(cè)出其中任一種污染菌，則說(shuō)明 樣品中含有具有果汁飲料污染能力的污染菌。
[0009] -種果汁飲料污染菌的快速篩查方法，采用4重PCR同時(shí)擴(kuò)增4種污染菌的基 因，再通過(guò)毛細(xì)管電泳分離所述4重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述4重PCR反應(yīng)中應(yīng)用引物SEQ ID NO. 1-8 〇
[0010] 本發(fā)明方法具體如下：
[0011] 步驟（1)、果汁飲料污染菌的培養(yǎng)及DNA模板提?。?br>[0012] 將檢測(cè)樣品在無(wú)氧環(huán)境中26°C靜置過(guò)夜富集培養(yǎng)；通過(guò)真空栗過(guò)濾收集細(xì)胞沉 淀于濾膜上；將濾膜轉(zhuǎn)移至反應(yīng)試管，加入50mM EDTA 480ul再加入10mg/ml溶菌酶120ul， 37°C孵育60min，13, OOOXg離心2min，移去上清液，之后采用試劑盒提取果汁飲料污染菌 的DNA模板；
[0013] 步驟（2)、多重PCR擴(kuò)增：
[0014] 將多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0015] 所述的多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20ul由100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合 引物 2ul，25mM 的 MgC124ul，5 X PCRBuf f er4ul，5U/ul 的 Taq 聚合酶 0· 7ul，DNA 模板 lul，余 量的雙蒸水組成；其中正向混合引物中SEQ ID NO. 1引物、SEQ ID NO. 3引物、SEQ ID NO. 5、 SEQ ID NO. 7引物的濃度比為1:1:1:1，反向混合引物中SEQ ID NO. 2引物、SEQ ID NO. 4引 物、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8 引物的濃度比為 1:1:1:1 ;
[0016] 所述的多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件是95°C預(yù)變性lOmin ;以94°C 30s ;58°C 30s ; 70°C lmin為1個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；4°C保溫；
[0017] 表1本發(fā)明用于污染菌的基因檢測(cè)的4重引物體系各引物序列
[0019] 步驟（3)、毛細(xì)管電泳分離條件：
[0020] 分離體系：lul所述步驟（2)中所得的擴(kuò)增產(chǎn)物與體積含量為95%去離子甲酰胺 38. 5ul，400bpDNA MarkerO. 5ul 混合均勻；
[0021] 分尚條件：在50°C、6· 0KV電壓下，分尚35min ;
[0022] 步驟（4)、檢測(cè)鑒定：
[0023] 步驟（2)中所得的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)毛細(xì)管電泳分離時(shí)，通過(guò)多重基因表達(dá)遺傳分 析系統(tǒng)自動(dòng)檢索、收集樣品中熒光信號(hào)判斷是否在基因片段長(zhǎng)度為160bp、192bp、201bp、 247bp相應(yīng)位置處出現(xiàn)特征峰；若在160bp相應(yīng)位置處出現(xiàn)特征峰，則判斷為該檢測(cè)樣品中 含有桔青霉Penicillium citrinum ;若在192bp相應(yīng)位置處出現(xiàn)特征峰，則判斷為該檢測(cè) 樣品中含有釀酒酵母Saccharomyces cereviseae ;若在201bp相應(yīng)位置處出現(xiàn)特征峰，貝lj 判斷為該檢測(cè)樣品中含有酵母菌Dekera naardenensis ;若在247bp相應(yīng)位置處出現(xiàn)特征 峰，貝判斷為該檢測(cè)樣品中含有黑曲霉Aspergillus niger。
[0024] 表2果汁飲料污染菌基因特征峰位置
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有如下特點(diǎn)：
[0027] 其一，本發(fā)明可在同一 PCR管中進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單，能快速確定果汁飲料中是否存在 污染菌，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確；
[0028] 其二，通過(guò)分析基因確定桔青霉Penicillium citrinum、釀酒酵母Saccharomyces cereviseae、酵母菌 Dekera naardenensis、黑曲霉 Aspergillus niger 在果汁飲料中的微 量存在，及時(shí)發(fā)現(xiàn)果汁飲料中有害菌，實(shí)現(xiàn)有效的監(jiān)測(cè)及預(yù)防作用；
[0029] 其三，本發(fā)明相對(duì)于目前其他以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)檢測(cè)手段，能夠在 一次反應(yīng)中集成檢測(cè)4種果汁飲料污染菌，節(jié)約了檢測(cè)成本，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，檢測(cè)時(shí)間由 原7~14天縮短到8h。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1為本發(fā)明具體實(shí)施例1的多重PCR-毛細(xì)管電泳譜圖；
[0031] 圖2為本發(fā)明具體實(shí)施例2的多重PCR-毛細(xì)管電泳譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的分析。
[0033] 實(shí)施例1 :
[0034] (1)果汁飲料污染菌的培養(yǎng)及DNA模板提取：
[0035] 挑取平板培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的桔青霉Penicillium citrinum、釀酒酵母 Saccharomyces cereviseae、酉孝母菌 Dekera naardenensis、黑曲霉 Aspergillus niger 單 菌落加入10mL成品蘋(píng)果汁中，混勻，制成菌懸液；取lmL該菌懸液加入1. 5ml離心管中， 13, OOOXg離心2min，收集細(xì)胞沉淀，移去上清液；加入480ul的50mMEDTA徹底重懸細(xì)胞； 加入120ul的10mg/ml溶酶菌，37°C孵育60min，13, 000Xg離心2min，移去上清液。之后按 照Qiagen公司的Genomic DNA Purification Kit試劑盒的使用說(shuō)明提取果汁飲料污染菌 的DNA模板，并使用紫外分光光度計(jì)在260nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定提取的DNA質(zhì)量，將DNA溶液 稀釋至250ng/ul，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0036] (2)四重PCR擴(kuò)增
[0037] 所用引物體系為表1所述的SEQ ID NO. l-8,20ulPCR反應(yīng)體系：100nM正向8， 20ulPCR反應(yīng)體系：100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgC124ul， 5 X PCRBuf f er4ul，5U/ul的Taq聚合酶0. 7ul，DNA模板lul，補(bǔ)足雙蒸水使總體積為20ul ; 95°C預(yù)變性lOmin ;以94°C 30s ;58°C 30s ;70°C lmin為1個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；4°C保 溫；（3)毛細(xì)管電泳分離條件
[0038] 分離體系：lul所述步驟（2)中所得的擴(kuò)增產(chǎn)物與95%去離子甲酰胺38. 5ul， 400bpDNA MarkerO. 5ul混合均勾；分離條件：在50°C、6. OKV電壓下，分離35min ;
[0039] 使用貝克曼庫(kù)爾使用貝克曼庫(kù)爾特的GenomeLabGeXP Genetic Analysis System 分析系統(tǒng)自動(dòng)對(duì)分離結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果圖1所示，在基因片段長(zhǎng)度為160bp、192bp、 201bp、247bp相應(yīng)位置處均出現(xiàn)特征峰，故四種污染菌基因被檢出，認(rèn)為檢測(cè)過(guò)程果汁對(duì)檢 測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響，使用本發(fā)明能夠捕捉到樣品中桔青霉Penicillium citrinum、釀酒酵母 Saccharomyces cereviseae、酉孝母菌 Dekera naardene