一種與高郵鴨體重、胸腿肌重和胸肌肌纖維性狀相關(guān)的分子標記、其獲取方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于家禽基因工程的技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種與高郵鴨體重、胸腿肌 重和胸肌肌纖維性狀相關(guān)的分子標記、其獲取方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胰島素增長因子-l(IGF-l)屬胰島素家族成員，是動物生長軸的重要基因之一， 具有促進細胞增殖和個體發(fā)育的功能。IGF-1可通過靶器官上的IGFs受體，促進蛋白合成， 肌肉干細胞增殖、成肌細胞分化及肌管融合等，從而促進骨骼肌的發(fā)育。試驗發(fā)現(xiàn)，在鴨胚 胎期，蛋內(nèi)注射外源IGF-1可以顯著提高出雛后鴨的體重和胸肌重，說明IGF-I對雛鴨的生 長具有促進作用。
[0003] 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水 平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP作為第三代分子標記，具有數(shù)量 多、分布廣、代表性強和遺傳穩(wěn)定性好等特點。目前已經(jīng)在動植物的遺傳多樣性分析、基因 作圖、分子標記輔助育種和功能基因?qū)W的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。結(jié)合PCR技術(shù)、電泳、 熒光燈方法的SNP檢測方法，在動植物遺傳育種中起到重要作用。高郵鴨是全國三大名鴨 之一，生長發(fā)育快，肉質(zhì)好，屬于肉蛋兼用型地方品種。在育種工作中，與改變個體遺傳特性 (人工誘變）相比較，改變品種遺傳結(jié)構(gòu)相對容易。而現(xiàn)有技術(shù)中尚未發(fā)現(xiàn)與與高郵鴨體 重、胸腿肌重和胸肌肌纖維性狀相關(guān)的分子標記與應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供了一種與高郵鴨體重、胸腿肌重和胸 肌肌纖維性狀相關(guān)的分子標記、其獲得方法及應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供了一種與高郵鴨體重、胸腿肌重和胸肌肌纖維性狀相關(guān)的分子標記， 所述分子標記位于SEQ ID NO: 1所示核苷酸的第190位，該位點的核苷酸為G或T。
[0006] 本發(fā)明還提供了一種獲取與高郵鴨體重、胸腿肌重和胸肌肌纖維性狀相關(guān)的分子 標記的方法，PCR擴增高郵鴨基因組DNA，擴增產(chǎn)物經(jīng)連接酶檢測反應(yīng)后測序，通過序列分 析獲取與高郵鴨體重、胸腿肌重和胸肌肌纖維性狀相關(guān)的分子標記。
[0007] 其中，PCR擴增所用引物對序列如SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示。
[0008] 其中，連接酶檢測反應(yīng)所用探針序列如SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6 所示。
[0009] 其中，連接酶檢測反應(yīng)產(chǎn)物長度170bp的為基因型GG，連接酶檢測反應(yīng)產(chǎn)物長度 172bp的為基因型TT，連接酶檢測反應(yīng)產(chǎn)物長度170bp和172bp的為基因型GT。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種與高郵鴨體重、胸腿肌重和胸肌肌纖維性狀相關(guān)的分子標記 在篩選高郵鴨體重、胸腿肌重及胸肌肌纖維性狀中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種與高郵鴨體重、胸腿肌重及胸肌肌纖維性 狀相關(guān)的分子標記，針對該分子標記位點的單核苷酸多態(tài)性，設(shè)計特定的引物擴增包含SNP 位點的基因片段，然后進行連接酶檢測反應(yīng)，測序分析，能夠簡單、快速、成本低、精確的檢 測其單核苷酸的多態(tài)性。對上述分子位點的基因型與高郵鴨70日齡體重、胸腿肌重和胸肌 肌纖維性狀進行關(guān)聯(lián)分析，可以用于家系選育中的早期選擇，在選配中提供分子依據(jù)，以提 高高郵鴨上市時的體重，增加經(jīng)濟效益。
【附圖說明】
[0012] 圖1是ABI3730型基因分析儀檢測與Genemapper分析結(jié)果。
【具體實施方式】
[0013] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細地解釋說明。
[0014] 本發(fā)明的與高郵鴨體重、胸腿肌重和胸肌肌纖維性狀相關(guān)的分子標記，所述分子 標記位于SEQ ID NO: 1所示核苷酸的第190位，該位點的核苷酸為G或T，導(dǎo)致該基因位點 的單核苷酸多態(tài)性。PCR擴增得到與高郵鴨體重、胸腿肌重和胸肌肌纖維性狀相關(guān)的分子標 記，其核苷酸序列為鴨IGF-1的部分基因組序列，序列如SEQ ID NO: 1所示。該序列中的第 190bp處有一個G190-T190的突變，導(dǎo)致該位點的單核苷酸多態(tài)性。
[0015] 針對上述位點的單核苷酸多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其獲取的方法，其中用于擴增 所述IGF-1基因和檢測該基因位點突變的正反向引物對序列如SEQ ID N0:2-3所示。
[0016] 其中用于對上述擴增產(chǎn)物進行連接酶檢測反應(yīng)（LDR)，所需的LDR探針序列如SEQ ID NO :4-6 所示。
[0017] 本發(fā)明的與高郵鴨體重、胸腿肌重和胸肌肌纖維性狀相關(guān)的分子標記用于篩選高 郵鴨體重、胸腿肌重和胸肌肌纖維性狀。
[0018] 本發(fā)明的獲取與高郵鴨體重、胸腿肌重和胸肌肌纖維性狀相關(guān)的分子標記的方 法，包括以下步驟：
[0019] 1、鴨血樣的采集
[0020] 本發(fā)明的試驗鴨來自江蘇省高郵鴨集團，在相同的日糧水平下飼喂的同日齡高郵 鴨和金定鴨種鴨群。采用一次性注射器從鴨翅下靜脈中抽取lml血液，注入經(jīng)高壓滅菌并 裝有200 μ 1 2%無菌的乙二胺四乙酸（EDTA)抗凝劑的1. 5ml離心管中，輕輕搖勾，記錄翅 號，-80 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0021] 2、DNA 的提取
[0022] 基因組DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法
[0023] (1)取上述全血30 μ 1置于1.5ml離心管，分別加入470 μ 1 1XSET緩沖液、 12. 5 μ 1 20% SDS (十二烷基硫酸鈉）和6 μ 1的10mg/ml蛋白酶Κ，混合均勻后放于55°C 水浴過夜；
[0024] (2)取出樣本于1. 5ml離心管，加入500 μ 1飽和苯酚，輕搖20min，lOOOOrpm離心 10min ；
[0025] (3)取上清，再次加入500 μ 1飽和苯酚，輕搖20min，lOOOOrpm離心10min ;
[0026] (4)取上清，加入500 μ 1氯仿-異戊醇（23 :1)輕搖20min，lOOOOrpm離心10min ;
[0027] (5)取上清，加入lml冰無水乙醇（-20°C )，來回搖擺以沉淀DNA，lOOOOrpm離心 lOmin后倒出乙醇；
[0028] (6)用1ml 75%乙醇清洗DNA -次，倒掉乙醇，置于50°C干燥箱內(nèi)烘干；
[0029] (7)待DNA完全干燥后加入300 μ 1滅菌后的雙蒸水溶解，50°C水浴鍋中過夜以溶 解DNA ;將DNA原液1 :100稀釋并進行分光光度計檢測濃度，0D值為1. 85-1. 94。
[0030] (8)將DNA濃度稀釋到50ng/ μ 1，存放于-20°c冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0031] 3、PCR 擴增
[0032] 擴增包含G190T位點的片段：根據(jù)GenBank的鴨IGF-1基因（NW_004677293)全序 列設(shè)計包含該位點的正反向引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以上述高 郵鴨基因組為模板，在包含待測位點序列的正反向引物、Taq DNA聚合酶、緩沖環(huán)境、dNTPs 存在的情況下，在PCR反應(yīng)條件下進行擴增，PCR產(chǎn)物大小為232bp，用于LDR反應(yīng)。
[0033] 所述引物對序列如下：
[0034] 上游引物序列為：5'-TTGCATGGAGTGGATGTGAT-3'（SEQ ID NO :2);
[0035] 下游引物序列為：5'-GCAGGAATAAGAGTGCCATGT-3'（SEQ ID NO :3)
[0036] PCR擴增反應(yīng)的具體步驟為：
[0037] 1) PCR擴增反應(yīng)體系準備：在200 μ 1的PCR薄壁管中，加入1 μ 1 DNA模板（50ng/ μ1)、2μ1 Bufer、0.6yl Mg2+(3mmol/L)、2yl dNTP(2mmol/L)、0.2yl Taq DNA 聚合酶 (5υ/μ1)、2μ1 Primer π?χ、12·2μ1 ddH20，共20μ1 PCR反應(yīng)體系，充分混勻后短暫離心， 最后加入20 μ 1石錯油。
[0038] 2)PCR 擴增反應(yīng)程序設(shè)置：在 Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems9600 上進 行擴增反應(yīng)，PCR擴增反應(yīng)程序為：95°C變性2min，40次循環(huán)（94°C 90s，50°C lmin 30s， 65°C 30s)65°C延伸lOmin，得到PCR擴增產(chǎn)物。
[0039] 3)反應(yīng)結(jié)束后，取2 μ 1反應(yīng)產(chǎn)