檢測人巨細(xì)胞病毒pp65基因的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及熒光探針PCR檢測人巨細(xì)胞病毒PP65基因 的方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 人巨細(xì)胞病毒（Human Cytomegalovirus, HCMV)，屬于皰瘆病毒科β亞科，是一種 雙螺旋DNA病毒。HCMV呈世界性分布，在人群中廣泛傳播，在人體感染過程中，分為急性感 染和潛伏感染，一經(jīng)感染，人體將終身攜帶。HCMV多以潛伏感染形式存在于人體多種細(xì)胞 中，在免疫系統(tǒng)功能正常的人體中，潛伏感染不致病，但HCMV感染在孕婦和嬰幼兒等免疫 功能低下的人群中，可導(dǎo)致包括致死在內(nèi)的嚴(yán)重后果。妊娠期婦女由于其內(nèi)分泌和免疫狀 態(tài)的改變可使體內(nèi)潛伏的HCMV被激活，通過母嬰垂直傳播給胎兒，導(dǎo)致死胎、流產(chǎn)、胎兒發(fā) 育遲緩及多種機(jī)型。此外，自身免疫病患者、接受免疫抑制治療患者、以及接受化療、放療的 腫瘤或器官骨髓移植的患者等極易通過感染而發(fā)生HCMV急性感染，引起諸如HCMV肝炎、肺 炎、單核細(xì)胞增多癥等HCMV致病表現(xiàn)。如當(dāng)骨髓移植，肝、腎、心臟等器官移植患者免疫功 能受損時(shí)，潛伏病毒被激活、增值而發(fā)生嚴(yán)重感染，將導(dǎo)致患者器官移植失敗甚至死亡。
[0003] 研究表明，一旦出現(xiàn)HCMV感染的臨床癥狀，抗病毒藥物不能控制該病的病理進(jìn) 程，這意味著抗病毒藥物必須在HCMV感染的臨床癥狀出現(xiàn)前就使用，這就有賴于實(shí)驗(yàn)室的 分析。
[0004] HCMV感染的常用檢測方法有病毒分離培養(yǎng)法和血清學(xué)方法。病毒分離培養(yǎng)法為 HCMV實(shí)驗(yàn)室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但培養(yǎng)所需時(shí)間過長，一般5-10天，結(jié)果受標(biāo)本保存時(shí)間影響 大，且分離培養(yǎng)條件和技術(shù)要求高，不適合大范圍推廣作為臨床常規(guī)檢測。血清學(xué)主要檢測 HCMV-IgG和IgM，IgG陽性僅能提示人體曾感染HCMV，不能證明是否為HCMV急性感染；IgM 陽性表明存在急性感染，但針對免疫功能低下的患者，機(jī)體難以產(chǎn)生足夠量的IgM，因此存 在大量假陰性結(jié)果，且不能區(qū)分潛伏感染和活動(dòng)性感染?？乖Y檢測技術(shù)是一項(xiàng)快速、敏 感的診斷技術(shù)，但是傳統(tǒng)檢測方法多以白細(xì)胞為病毒抗原檢測載體，限制了其臨床應(yīng)用。
[0005] PP65是HCMV病毒復(fù)制的早期蛋白，它出現(xiàn)于病毒感染的早期，在細(xì)胞感染后3-4 小時(shí)即開始出現(xiàn)，是HCMV病毒含量最豐富的蛋白。其功能是將病毒的DNA錨定在受感染細(xì) 胞的核膜上，在胞漿的高爾基體內(nèi)合成，然后運(yùn)回核內(nèi)。隨著研究的深入，HCMV-PP65抗原 被認(rèn)為是HCMV感染表達(dá)的早期抗原，PP65抗原分析能敏感地在早期預(yù)測HCMV病。申請?zhí)?為201310549511. 4的發(fā)明專利公開了一種應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測HCMV PP65抗原，利用與 PP65具有特異性的適配子，構(gòu)建了一種磁珠-適配子-抗原-單克隆抗體復(fù)合體，提高了 PP65檢驗(yàn)效率。申請?zhí)枮?01310549370. 6的發(fā)明專利公開了一種基于生物芯片快速檢測 PP65的方法，利用與PP65具有特異性的適配子，應(yīng)用生物芯片技術(shù)檢測HCMVPP65抗原，提 高了 PP65檢驗(yàn)效率。申請?zhí)枮?01410040889. 6的發(fā)明專利公開了一種檢測人巨細(xì)胞病毒 (HCMV) PP65抗原的ELISA方法，包括以下步驟：（1)制備檢測試劑盒：包被有大鼠抗重組 PP65322-561多克隆抗體（pAb)的酶標(biāo)板、兔抗重組PP65322-561pAb、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP-羊抗兔 IgG、PBST洗滌液、底物顯色液、終止液和封板膜；（2)制備待測標(biāo)本；（3)檢測人巨細(xì)胞病 毒PP65抗原。
[0006] 核酸檢驗(yàn)作為一種醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)已經(jīng)在感染性病原體診斷中體現(xiàn)出了巨大的優(yōu) 勢和作用。現(xiàn)有HCMV試劑盒大多檢測外周血，采集標(biāo)本會(huì)造成創(chuàng)傷，且存在靈敏度低、穩(wěn)定 性差等缺點(diǎn)。研發(fā)無創(chuàng)性、高靈敏度和高特異性的HCMV核酸檢測試劑盒對診斷HCMV感染 有著積極的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種檢測人巨細(xì)胞病毒PP65基因的方法， 該方法操作簡單，具有無創(chuàng)性、靈敏度高和特異性高的優(yōu)點(diǎn)，適用于臨床分子診斷。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為： 一種檢測人巨細(xì)胞病毒PP65基因的方法，所述的方法具體為： 從待測樣本中提取DNA，以所得DNA為模板，采用特異性引物對和熒光標(biāo)記探針進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光探針PCR檢測；所述特異性引物對是序列如SEQ ID N0 :1所示的上 游引物PP65-F和序列如SEQ ID N0 :2所示的下游引物PP65-R ;所述熒光標(biāo)記探針序列如 SEQ ID N0:3所示。熒光探針PCR檢測是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信 號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在本 發(fā)明中，設(shè)計(jì)了一條帶有FAM熒光素的熒光標(biāo)記探針，其在PCR反應(yīng)的退火期與PCR擴(kuò)增的 目標(biāo)互補(bǔ)單鏈DNA雜交，并被Taq DNA聚合酶的5'核酸外切酶活性水解，水解后FAM熒光 素將遠(yuǎn)離3'淬滅基團(tuán)，從而在激發(fā)光作用下產(chǎn)生熒光信號(hào)。
[0009] 所述的一種檢測人巨細(xì)胞病毒PP65基因的方法，所述的待測樣本為臨床尿液樣 本，以尿液樣本為待檢測樣本，實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的無創(chuàng)檢測。
[0010] 所述的一種檢測人巨細(xì)胞病毒PP65基因的方法，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系： 2. 5 XPCR buffer (已包含 Taq DNA 聚合酶)8ul，20 X Enhancer buffer lul，10uM 上游引物 PP65-F lul，10uM 下游引物 PP65-F lul，10uM 探針 PP65-P 0.5ul，模板 DNA 2ul，其余為無 核酸酶的滅菌高純雙蒸水，終體積為20ul。
[0011] 所述的一種檢測人巨細(xì)胞病毒PP65基因的方法，所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋海?) 50°C 處理2分鐘，95°C預(yù)變性2分鐘；（2)按照95°C變性15秒，55°C退火40秒為一個(gè)循環(huán)，共循 環(huán)40次。
[0012] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種用于檢測人巨細(xì)胞病毒PP65基因的試劑盒，該 試劑盒對HCMVPP65基因進(jìn)行PCR檢測，有很好的特異性和靈敏度。
[0013] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為： 用于檢測人巨細(xì)胞病毒PP65基因的試劑盒，所述試劑盒包括用于擴(kuò)增PP65基因的特 異性引物對，所述特異性引物對是序列如SEQ ID N0 :1所示的上游引物PP65-F和序列如 SEQ ID N0:2所示的下游引物PP65-R。利用特異性引物對可對待測樣本的DNA進(jìn)行特異性 擴(kuò)增。
[0014] 進(jìn)一步，所述試劑盒還包括熒光標(biāo)記探針，所述熒光標(biāo)記探針序列如SEQ ID N0 :3 所示，該試劑盒對HCMV進(jìn)行熒光探針PCR檢測，有很好的特異性和靈敏度。
[0015] 進(jìn)一步，所述試劑盒還包括HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)品，所述的HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)品是將得到 的HCMVPP65基因序列連接到載體PBackZero-T vector上形成PBackZer〇-HCMVPP65質(zhì)粒 即作為HCMV核酸標(biāo)準(zhǔn)品，利用標(biāo)準(zhǔn)品做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定 量分析。本發(fā)明中，HCMVPP65基因的序列是通過TA克隆連接到載體PBackZero-T vector 上進(jìn)行克隆，得到PBackZer〇-HCMVPP65質(zhì)粒。ΤΑ克隆技術(shù)（ΤΑ cloning)利用Taq聚合酶 具有末端轉(zhuǎn)移酶（TdT)活性，但卻不具有3' -5'端外切酶校準(zhǔn)活性的特點(diǎn)，可在PCR產(chǎn)物的 3'端加上一個(gè)非模板依賴堿基"A"。pMD18-T是一種高效克隆PCR產(chǎn)物的專用載體，它是 由PUC18載體在Xba I和Sal I識(shí)別位點(diǎn)間插入一個(gè)EcoR V位點(diǎn)，然后用EcoR V進(jìn)行酶 切使質(zhì)粒線性化，并在它的3'端添加"T"構(gòu)建而成。因其3'端帶有一個(gè)突出的"T"尾，能 高效地與帶"A"尾的PCR產(chǎn)物連接，極大地提高了克隆的效率。TA克隆是目前克隆PCR產(chǎn) 物最簡便、快捷的方法。
[0016] 進(jìn)一步，所述試劑盒還包括從待測樣本中提取DNA的DNA提取試劑，所述的DNA提 取試劑為本領(lǐng)域提取DNA常用的試劑。
[0017] 進(jìn)一步，所述試劑盒還包括對提取的DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增試劑，如PCR 緩沖液、MgCl2溶液、dNTPs、DNA聚合酶等等。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于：（1)本發(fā)明的一種檢測人巨細(xì)胞病毒PP65基因的方法， 該方法操作簡單，具有無創(chuàng)性、靈敏度高和特異性高的優(yōu)點(diǎn)，適用于臨床分子診斷。（2)本發(fā) 明的用于檢測人巨細(xì)胞病毒PP65基因的試劑盒對HCMVPP65基因進(jìn)行PCR檢測，有很好的 特異性和靈敏度。
[0019]
【附圖說明】 圖1為標(biāo)準(zhǔn)品PCR熒光曲線圖； 圖2為樣本PCR熒光曲線圖。
[0020]
【具體實(shí)施方式】 所舉實(shí)施例是為了更好地對本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行說明，但并不是本發(fā)明的內(nèi)容僅限于所 舉實(shí)施例。所