檢測牛腺病毒的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及PCR檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及用于檢測各血清型牛腺病毒的靶序 列、熒光定量PCR引物和探針，本發(fā)明還涉及利用該靶序列進(jìn)行牛腺病毒檢測的方法和試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛腺病毒（Bovine adenovirus, BAV)屬腺病毒科哺乳動(dòng)物腺病毒屬，為雙鏈DNA 病毒，可導(dǎo)致牛犢的呼吸道、消化道感染。BAV的感染較為普遍，許多國家從病牛及外表健康 的犢牛的分泌物及糞便中分離發(fā)現(xiàn)，BAV不僅感染牛，還能使羊和鹿發(fā)病。BAV分為兩個(gè)群， 9個(gè)血清型，其中血清3型的感染較為普遍，研究最多。牛血清是生物制品行業(yè)不可缺少的 原材料，外源因子的污染嚴(yán)重影響生物制品的質(zhì)量，因此，對(duì)生物制品中牛病毒的檢測非常 重要，其中包括對(duì)牛腺病毒的檢測。
[0003] 目前生物制品行業(yè)各生產(chǎn)廠家普遍采用細(xì)胞培養(yǎng)法，血吸附法，免疫熒光法進(jìn)行 檢測，但這些方法存在敏感度低，檢測周期長，檢測精度低，結(jié)果判定易受多種因素影響，客 觀性不足，勞動(dòng)量大等問題；常規(guī)PCR檢測法雖然敏感性、穩(wěn)定性、特異性較好，但容易污 染，造成假陽性結(jié)果；已有的熒光定量PCR法雖然克服了上述方法的缺陷，但是僅能檢測牛 腺病毒3型，具有檢測的局限性，并且僅能夠進(jìn)行牛腺病毒的定性檢測，無法定量，檢測特 異性、靈敏度、檢測范圍等參數(shù)均未經(jīng)驗(yàn)證。因此迫切需要一種能夠同時(shí)檢測各血清型的牛 腺病毒的方法，以降低生物制品企業(yè)的生產(chǎn)成本，提高企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供用于檢測各血清型牛腺病毒的特異、靈敏、快速、簡便的方 法以及檢測試劑盒。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫已報(bào)道的牛腺病毒基因序列比對(duì)，搜 索到牛腺病毒3型全基因序列，序列號(hào)為AF030154. 1，GI: 2935210,使用NCBI在線BLAST中 的conserved domains分析功能，基因組606_1348bp為保守區(qū)基因序列E1A，該序列在牛腺 病毒所有血清型中高度保守，找到了牛腺病毒各血清型特異性的保守靶序列，其核苷酸序 列如SEQ ID N0. 4所示，該靶序列是檢測各血清型牛腺病毒的遺傳標(biāo)記物。此外，本領(lǐng)域技 術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，該序列的特異性片段也可以作為檢測牛腺病毒的遺傳標(biāo)記物。該基因組 保守區(qū)的遺傳標(biāo)志物在牛腺病毒各個(gè)血清型中高度同源，本發(fā)明根據(jù)該保守序列，通過反 復(fù)對(duì)比、篩選，設(shè)計(jì)了用于檢測該遺傳標(biāo)志物的特異性引物對(duì)和探針。本發(fā)明引物和探針不 但適用于3型牛腺病毒的檢測，還適用目前已知的其他8個(gè)血清型牛腺病毒的檢測。
[0006] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選的特異性引物對(duì)的序列為：
[0007] 上游引物序列為：5'-GAAGAGGATGAGTGTCTGAATGC-3'
[0008] 下游引物序列為：5'-TCTATCCACGGTTCTGGAGACAT-3'
[0009] 熒光探針序列為：
[0010] (FAM)5, -CTGTTTCCTGATCCCTGGCTAAATGCAG-3'（TAMR A)。
[0011] 本發(fā)明提供了在制備檢測牛腺病毒試劑盒中的應(yīng)用。
[0012] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了含有上述特異性引物對(duì)的試劑盒。
[0013] 含有上述特異性引物對(duì)的試劑盒，可通過普通PCR方法實(shí)現(xiàn)對(duì)各血清型牛腺病毒 的特異、快速檢測，當(dāng)擴(kuò)增的目的條帶為120bp左右時(shí)（如圖1所示），將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 基因測序，并將測序結(jié)果與該保守區(qū)基因序列（SEQ ID N0. 4)進(jìn)行同源性比對(duì)，若與該保守 區(qū)基因序列一致（如圖2所示），則說明待測樣品含有牛腺病毒。
[0014] 含有上述特異性引物對(duì)的試劑盒，可通過SYBR Green法熒光定量PCR實(shí)現(xiàn)對(duì)各血 清型牛腺病毒的特異、快速檢測。
[0015] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，SYBR Green法熒光定量PCR檢測牛腺病毒的50μ1反 應(yīng)體系為：反轉(zhuǎn)錄酶，2μ1 ;擴(kuò)增酶和底物混合物，25μ1 ;10μΜ上、下游引物，各2μ1 ;R0X Dye II，1 μ 1 ;Rnase free ddH20,14 μ 1，病毒基因組模板：4 μ 1。然后采用AB 7500熒光定 量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，設(shè)置SYBR Green熒光信號(hào)采集條件，循環(huán)程序：42°C反轉(zhuǎn)錄5min， 95°C預(yù)變性lOsec，1個(gè)循環(huán)；95°C變性5sec，60°C退火延伸34sec(收集熒光信號(hào)），40個(gè) 循環(huán)；熔解曲線分析，95°C，15sec ;60°C，lmin ;95°C，15seC(收集熒光信號(hào)）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品 擴(kuò)增結(jié)果建立定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。陽性組擴(kuò)增曲線的CT值應(yīng)小于30,熔解曲線峰形單一， 且熔解曲線峰值高于80°C，證明引物特異性較好，無非特異性擴(kuò)增；陰性對(duì)照組和空白對(duì) 照組擴(kuò)增曲線CT值均大于30,熔解曲線出現(xiàn)雙峰且峰值低于80°C，則為陰性擴(kuò)增。
[0016] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了含有上述特異性引物對(duì)和熒光探針的試劑盒。
[0017] 含有上述特異性引物對(duì)和熒光探針的試劑盒可通過Taqman法熒光定量PCR實(shí)現(xiàn) 對(duì)各血清型牛腺病毒的特異、快速檢測。
[0018] 具體地，該試劑盒基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)待測樣本提取基因組DNA后以其 為模板，利用SEQ ID N0. 1、SEQ ID N0. 2所示的特異性引物對(duì)和SEQ ID N0. 3所示的熒光 探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測待測樣本中的牛腺病毒。
[0019] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，Taqman法熒光定量PCR檢測牛腺病毒的50 μ 1反應(yīng) 體系為：反轉(zhuǎn)錄酶，2μ1 ;擴(kuò)增酶和底物混合物，25μ1 ;10μΜ上、下游引物，各ΙμL ;10uM 熒光探針，2 μ 1 ;R0X Dye II，1 μ 1 ;Rnase free ddH20,14 μ 1 ;病毒基因組模板，4 μ 1。然后 采用ΑΒ 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，設(shè)置5'端FAM熒光信號(hào)采集，3'端TAMRA熒光 信號(hào)采集，循環(huán)程序：42°C反轉(zhuǎn)錄5min，95°C預(yù)變性10sec，l個(gè)循環(huán)；95°C變性5sec，60°C 退火延伸34sec (收集熒光信號(hào)），40個(gè)循環(huán)，建立定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品擴(kuò)增曲線判 定結(jié)果。
[0020] 在對(duì)照有效擴(kuò)增的情況下，樣品檢測結(jié)果可信，否則試驗(yàn)需要重復(fù)；在檢測中兩種 對(duì)照為有效擴(kuò)增時(shí)，樣本結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0021] Ct值小于40的標(biāo)本為陽性結(jié)果；
[0022] Ct值大于40或無 CT值的標(biāo)本為陰性結(jié)果；
[0023] Ct值在35-40之間的標(biāo)本需要重復(fù)，重復(fù)試驗(yàn)如Ct值依然低于40判定為陽性擴(kuò) 增，超過40或無 CT值判定為陰性擴(kuò)增。
[0024] 本發(fā)明提供了上述兩種試劑盒在生物制品質(zhì)量檢測中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明提供了一種檢測生物制品中牛腺病毒的方法，對(duì)待測生物制品樣本提取基 因組DNA后以其為模板，利用SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2所示的特異性引物對(duì)和SEQ ID NO. 3所不的9?光探針進(jìn)彳丁 Taqman 9?光定量PCR，檢測待測生物制品樣本中的牛腺病毒；
[0026] 或?qū)Υ郎y生物制品樣本提取基因組DNA后以其為模板，利用SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2所示的特異性引物對(duì)進(jìn)行SYBR Green熒光定量PCR，檢測待測生物制品樣本中的牛腺 病毒。
[0027] 本發(fā)明提供的試劑盒，還包括熒光定量反應(yīng)液，陰性模板和陽性模板，所述陰性模 板為無菌水，所述陽性模板為牛腺病毒基因組DNA。
[0028] 本發(fā)明對(duì)基于上述兩種熒光定量PCR方法的試劑盒的檢測靈敏度進(jìn)行了研究：實(shí) 驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的特異性引物對(duì)和/或探針運(yùn)用Taqman熒光定量PCR和SYBR Green熒 光定量？〇?檢測牛腺病毒，檢測范圍為102-108拷貝/^1，靈敏度均能達(dá)到102拷貝/^1。
[0029] 現(xiàn)有技術(shù)中采用SYBR Green法熒光定量PCR檢測牛腺病毒的特異性較差，檢測時(shí) 常有非特異性擴(kuò)增，由引物二聚體、引物發(fā)卡結(jié)構(gòu)等造成，容易造成假陽性，無法保證檢測 的準(zhǔn)確性。本發(fā)明所設(shè)計(jì)引物經(jīng)普通PCR檢測，無引物二聚體等結(jié)構(gòu)。進(jìn)行SYBR Green法 熒光定量PC