同時鑒別感染人的三種H5亞型禽流感病毒組合的GeXP快速檢測引物組、試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于禽類病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種同時鑒別感染人的三種H5亞 型禽流感病毒組合的GeXP快速檢測引物組、試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感是由禽流感病毒引起的一種禽類急性傳染病，同時某些亞型禽流感病毒也 能感染人類。禽流感病毒根據(jù)其表面糖蛋白血凝素（HA)和神經(jīng)氨酸酶（NA)的抗原關(guān)系差 異，可將其分為16種HA亞型和9種NA亞型。根據(jù)其致病性可分為高致病性禽流感和低致 病性禽流感，高致病性禽流感包括H5和H7亞型。特別是近年來頻繁爆發(fā)的H5亞型禽流感 疫情給許多國家和地區(qū)的養(yǎng)禽業(yè)帶造成了巨大的經(jīng)濟損失。H5亞型禽流感病毒的一些亞型 組合除了其對禽類的高致病性外，還能跨種間傳播感染人。1997年香港地區(qū)首次出現(xiàn)人感 染H5N1禽流感病例，2003年之后多個國家相繼出現(xiàn)H5N1禽流感病毒感染人事件，自2003 年以來，H5N1高致病性禽流感開始在東南亞地區(qū)廣泛流行，數(shù)月間傳播到了周邊以前未有 該病報道的8個國家。該病在2005年期之前都只在東南亞的動物和人流行感染，但之后病 毒開始從該地區(qū)經(jīng)過中亞傳播到了歐洲和中東地區(qū)。目前已有16個國家650人感染發(fā)病， 患者死亡率高達60%以上。0ΙΕ報道了在至少60個國家的家禽和野生鳥類中暴發(fā)了 H5N1 的感染。H5N2亞型禽流感病毒在禽類中廣泛存在，該病毒在雞體內(nèi)經(jīng)過傳代以后，可以發(fā) 生突變，有可能變?yōu)楦咧虏⌒郧萘鞲胁《?，同時野鳥和家禽也間接給H5N2亞型低致病性禽 流感病毒在野鳥內(nèi)的跨種間傳播提供了機會。另外，H5N2亞型流感病毒還能夠感染哺乳動 物，甚至是人類，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了極大的威脅。據(jù)報道日本至少有77人感染低致病 H5N2型禽流感病毒，這些人沒有出現(xiàn)感染禽流感病毒的癥狀。2014年5月中國四川省檢測 出一例人感染h5n6禽流感病例，患者死亡，這是全球首例人感染H5N6禽流感的個案。2014 年12月23日，國家衛(wèi)生計生委向WHO通報廣東省發(fā)生一例人感染H5N6禽流感實驗室確 診病例，患者經(jīng)救治后康復。2015年2月9日和2015年7月11日國家衛(wèi)生計生委分別向 WHO通報云南省發(fā)生兩例人感染H5N6禽流感實驗室確診病例，兩名患者均死亡。上述事實 表明H5N1、H5N2、H5N6三種H5亞型禽流感病毒組合能夠感染人，并且H5N1和H5N6亞型組 合可以導致人類死亡。
[0003]目前，禽流感病毒實驗室檢測技術(shù)主要包括病毒的分離及培養(yǎng)、血清學試驗、分子 生物學實驗和免疫熒光等方法，且病毒的分離與培養(yǎng)是診斷禽流感病毒感染的"金標準"。 由于禽流感亞型眾多且新的變異株不斷出現(xiàn)，使用上述檢測方法對其進行分型和診斷不僅 存在著操作方法復雜，而且檢測周期長及容易受抗體等因素影響使得檢測結(jié)果不能準確和 及時。雖然多重PCR有著能同時擴增出多個目的因片段進而實現(xiàn)多種病原體的快速診斷并 降低檢驗成本的優(yōu)點，但是普通多重PCR在擴增的過程中容易受到目的基因模板的特性、 引物濃度和比例及PCR所用的試劑之間的相互作用等的影響，進而導致樣品擴增效率不一 致使得檢測結(jié)果的準確性大大降低。GeXP多基因遺傳表達分析系統(tǒng)的多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈 反應(yīng)（Multiplex reverse transcription-polymerase chainreaction, mRT-PCR)是由通 用引物（上游加熒光標記）和特異性嵌合引物（基因特異性引物5'末端連接通用引物序 列）相結(jié)合建立多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)體系，采用通用引物引發(fā)的策略，可以克服普通 多重PCR存在的擴增效率不一的問題。此外，該方法利用毛細管電泳進行產(chǎn)物的分離，大大 提高了檢測結(jié)果的靈敏度和可靠性。
[0004] 由于H5N1、H5N2、H5N6三種感染人的H5亞型禽流感病毒組合感染人具有相似的臨 床癥狀，現(xiàn)有的的診斷技術(shù)又很難在較短時間內(nèi)對其作出準確的分型和判定，不利于其防 控及應(yīng)急措施的制訂。目前，檢測H5亞型AIV的核酸檢測方法多是針對其HA基因，同時檢 測H5N1、H5N2、H5N6三種感染人的H5亞型禽流感病毒組合并進行分型的技術(shù)尚未見有報 道。
[0005] 公開于該【背景技術(shù)】部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng) 當被視為承認或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明建立的GeXP多重PCR技術(shù)能夠同時對感染人的 H5N1、H5N2和H5N63種亞型組合禽流感病毒進行檢測和分型，達到可以快速診斷和鑒別3種 感染人H5亞型禽流感病毒的目的，對3種H5亞型禽流感流行病學調(diào)查及其防控，保障人類 公共衛(wèi)生的安全和健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種同時鑒別感染人的三種H5亞型禽流感病毒 組合的GeXP快速檢測引物組、試劑盒及其應(yīng)用。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] 一種同時鑒別感染人的三種H5亞型禽流感病毒組合的GeXP快速檢測引物組，包 括5對特異性引物，分別是引物對A1和A2、引物對B1和B2、引物對C1和C2、引物對D1和 D2、引物對E1和E2,其分別具有如SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 10所示的序列。
[0010] 作為優(yōu)選，所述的同時鑒別感染人的三種H5亞型禽流感病毒組合的GeXP快速檢 測引物組，還包括1對通用引物，上游通用引物為Cy5-Tag-F，下游通用引物為Tag-R，分別 具有如SEQ ID No. 11至SEQ ID No. 12所示的序列。
[0011] 一種同時鑒別感染人的三種H5亞型禽流感病毒組合的GeXP快速檢測試劑 盒，包括反轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)液、PCR反應(yīng)液、DEPC水和超純水；所述的反轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)液含有 5XReverse Transcriptase Buffer、50pmol Random Primer(12mer)、10mM dNTP Mixture、 40U Ribonuclease Inhibitor 和 5U/μ L AMV Reverse Transcriptase;所述的 PCR 反應(yīng) 液含有 10XPCR buffer、25mM MgCl2、10mM dNTP Mixture，5 對特異性引物混合物，ΙΟμΜ/L 上、下游通用引物混合物，JumpStart Taq DNA Polymerase;所述的5對特異性引物分別是 引物對A1和A2、引物對B1和B2、引物對C1和C2、引物對D1和D2、引物對E1和E2 ;1對通 用引物分別為Cy5-Tag-F和Tag-R，其分別具有如SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 12所示的序 列。
[0012] 作為優(yōu)選，所述的5對特異性引物中引物對A1和A2、引物對B1和B2、引物對C1和 C2、引物對D1和D2、引物對E1和E2在PCR反應(yīng)體系中對應(yīng)的的摩爾濃度分別為150nmol/ L、150nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、150nmol/L ;所述的 1 對通用引物 Cy5_Tag_F 和 Tag-R 在PCR反應(yīng)體系中的摩爾濃度為500nmol/L。
[0013] 作為優(yōu)選，所述的反轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)液每管9 μ L，含有5 X Reverse Transcriptase Buffer 5 μL、50pmol Random Primer(12mer)lμL、10mM dNTP Mixture 2 μL、40U Ribonuclease Inhibitor 0· 5 μ L 和 5U/μ L AMV Reverse Transcriptase 0.5yL;所述 的 PCR 反應(yīng)液每管 9.7yL，含有 10XPCR buffer 2.5yL，25mM MgCl22.5yL，10mM dNTP Mixture 1 μ L，5對特異性引物混合物1. 25 μ L，10 μ M/L上、下游通用引物混合物1. 25 μ L， JumpStart Taq DNA Polymerase 1· 2 μ L ;所述的 DEPC 水和超純水各 lmL。
[0014] 本發(fā)明還提供了所述的同時鑒別感染人的三種H5亞型禽流感病毒組合的GeXP快 速檢測引物組或所述的同時鑒別感染人的三種H5亞型禽流感病毒組合的GeXP快速檢測試 劑盒在鑒別H5N1、H5N2和H5N6亞型禽流感病毒中的應(yīng)用。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明