一個月一次地轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)培養(yǎng)基中。ATCC 30929生 長于填充JOHNSONS培養(yǎng)基的無菌瓶中。
[0058] 包載微藻的混雜藻酸鹽-二氧化硅珠粒
[0059] 所建立的通過一鍋工藝法成功合成混雜藻酸鹽-二氧化硅珠粒的實驗方法與步 驟涉及通過將用NaOH 0. 1M調(diào)節(jié)pH于約4和約6之間的聚硅酸（H2Si03) (5mL，0. 1-2M)與藻 酸鈉的溶液（5mL，0. 5-5wt% )和杜氏鹽藻（ATCC-30929)的活細胞懸液混合而制備混雜藻 酸鹽-二氧化硅溶液。然后，將混合物滴入聚陽離子聚氯化（二烯丙基二甲基銨）（PDADMAC) (0. 4-lOwt% )含CaCl2(5-100mM)的水溶液中。在混合物中溫育約3小時后，用新鮮培養(yǎng) 基洗滌包載微藻的混雜藻酸鹽-二氧化硅珠粒三次之后轉(zhuǎn)移到JOHNSONS培養(yǎng)基存在的無 菌燒瓶中。
[0060] 在適當?shù)臅r候，活細胞懸浮液從制備中剔除而混雜藻酸鹽-二氧化硅珠粒如上另 外合成。
[0061] 光合活性
[0062] 對含有微藻的混雜珠粒光合活性進行檢測，并通過在購自HansaTech(英格蘭諾 ?？耍┑目死耍–lark)細胞容器中生產(chǎn)氧進行監(jiān)測。該過程包括放置于2-15個珠粒，優(yōu) 選2-8個珠粒，優(yōu)選約3個珠粒在lmL與NaHC03 (10 μ L，0. 6M)混合的JOHNSONS培養(yǎng)基中 的懸浮液中。
[0063] 包載于藻酸鹽-二氧化硅珠粒中的微藻正如圖2中的報道能夠產(chǎn)氧超過9個月。 時間零對應(yīng)于微藻囊封于混雜珠粒中的時間。
[0064] 實施例2 :混雜藻酸鹽-二氧化硅珠粒相比于藻酸鹽膠囊的機械耐受性
[0065] 如同實施例1中提供的那樣使用或不使用活細胞進行實驗。藻酸鹽和混雜藻酸 鹽-二氧化硅珠粒實現(xiàn)對照穩(wěn)定性研究。為此目的，珠粒在合成后轉(zhuǎn)移至生物培養(yǎng)基中。為 了評價其機械耐受性，珠粒在約250rpm的攪拌條件下放置于培養(yǎng)基中約1小時-約10小 時，優(yōu)選約2小時并將珠粒移出，對破裂的珠粒計數(shù)。如圖3和本文以下表1中所示，藻酸 鹽-二氧化硅珠粒比藻酸鹽珠粒顯示更高數(shù)目的完整珠粒。通過增加進入PDADMAC/CaCl2溶液中的溫育時間，機械耐受性也增強。從而二氧化硅與藻酸鹽的組合增強了混雜珠粒的 機械耐受性。
[0066] 表 1 :
[0067] 各種組成的珠粒的機械耐受性。藻酸鹽/PDADMAC和藻酸鹽/PDADMAC/二氧化硅 珠粒在液中都培養(yǎng)約1小時。藻酸鹽/二氧化硅珠粒在CaCl 2溶液中培 養(yǎng)約1小時。其耐受性表示為其楊氏模量的值。這些值作為具有標準偏差（η = 3)的平均 值給出。
[0069] 實施例3 :溫育時間對混雜藻酸鹽-二氧化硅珠粒平均直徑的影響的研究
[0070] 如實施例1中提供那樣進行實驗。進入PDADMAC/CaCl2溶液中的溫育時間從1分 鐘變到48小時（2880分鐘）。此外，隨時間還觀察到珠粒的收縮現(xiàn)象，后者能夠通過二氧化 硅在PDADMAC/CaCl2溶液中的聚合過程進行解釋，這個聚合過程隨時間的推移更加有效，由 此導(dǎo)致產(chǎn)生更小尺寸的珠粒。珠粒收縮的動力學(xué)在圖4中圖形化報告?？雌饋硎湛s在第一 個小時內(nèi)非常突出而在24小時（1440分鐘）之后達到穩(wěn)定尺寸。
[0071] 實施例4 :根據(jù)溫育時間通過混雜藻酸鹽-二氧化硅珠粒中包載的微藻光化學(xué)產(chǎn) 氧
[0072] 如實施例1中提供那樣進行實驗。進入PDADMAC/CaCl2溶液中的溫育時間從15分 鐘變?yōu)?4小時（1440分鐘）。結(jié)果報告于圖5中，其中微藻的產(chǎn)氧量在囊封后的第0、1、4 和7天進行分析。因此，在PDADMAC/CaCl2溶液中珠粒的溫育時間對包載的微藻的代謝活 性沒有影響，如圖5中所示。
[0073] 本發(fā)明提供了以下的優(yōu)點：
[0074] -經(jīng)由一鍋環(huán)境友好的低成本工藝方法合成的幾毫米的混雜藻酸鹽-二氧化硅珠 粒表現(xiàn)出良好的球形形狀，也有很好的機械和化學(xué)穩(wěn)定性?？梢酝ㄟ^改變制備方法的物理 和化學(xué)參數(shù)調(diào)節(jié)（在殼和核中）的珠粒的尺寸和孔的尺寸。獲得的具有所選定的直徑和所 選擇的孔尺寸的珠粒能夠同樣用于各種純化方法和裝置，特別是色譜柱中。
[0075] -由于整個珠粒體積內(nèi)的高度多孔結(jié)構(gòu)允許營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物最優(yōu)擴散，細胞的 大生物質(zhì)能夠囊封于珠粒內(nèi)而外觀無裂縫和泄漏。因此，在培養(yǎng)基中并未觀察到活細胞生 長。雖然細胞能夠在珠粒內(nèi)增殖，但是沒有出現(xiàn)溶脹現(xiàn)象；
[0076] -關(guān)于珠粒中包載的細胞的生物活性和長期生存能力的維持，細胞在至少9個月 或更多的時間內(nèi)保持活力。
【主權(quán)項】
1. 具有毫米級尺寸包載生物活性物質(zhì)的珠粒，其中，所述珠粒包括： -所述生物活性物質(zhì)，選自由細胞、細胞器、酶、藥物、前藥或它們的混合物組成的組， _多孔核，和 -多孔殼，所述多孔核包括混雜藻酸鹽-二氧化硅（1)并且所述多孔殼包括二氧化硅和 二氧化硅濃縮劑（2)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的混雜藻酸鹽-二氧化硅珠粒，其中所述二氧化硅濃縮劑（2) 是長鏈聚胺。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的混雜藻酸鹽-二氧化硅珠粒，其中所述二氧化硅濃縮劑（2) 是聚陽離子PDADMAC。4. 根據(jù)前述權(quán)利要求1-3中任一項所述的混雜藻酸鹽-二氧化硅珠粒，其中外部多孔 層包含尺寸介于lnm和500nm之間的孔。5. 根據(jù)前述權(quán)利要求1-4中任一項所述的混雜藻酸鹽-二氧化硅珠粒，其中外部多孔 層的厚度介于1ym和10μπι之間。6. 根據(jù)前述權(quán)利要求1-5中任一項所述的混雜藻酸鹽-二氧化硅珠粒，其中混雜藻酸 鈣-二氧化硅（3)的中間層形成于所述核和所述多孔殼之間。7. 根據(jù)前述權(quán)利要求1-6中任一項所述的混雜藻酸鹽-二氧化硅珠粒，其中所述細胞 選自由光合活性細胞（如微藻）、細菌、動物細胞或真菌（包括酵母細胞）組成的組。8. -種用于制備根據(jù)前述權(quán)利要求1-7中任一項所述的混雜藻酸鹽-二氧化硅珠粒的 方法，所述方法包括以下步驟： -將一種或多種二氧化硅前體與藻酸鹽的溶液混合，所述溶液的pH介于2和10之間， 并且與將要囊封于所述珠粒中的生物活性物質(zhì)混合； -將混合物滴入二氧化硅濃縮劑的水性溶液中；以及 -溫育所獲得的珠粒持續(xù)介于1分鐘和24小時之間的時間段。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述二氧化硅濃縮劑是長鏈聚胺。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述長鏈聚胺是聚陽離子PDADMAC。11. 根據(jù)前述權(quán)利要求8-10中任一項所述的方法，其中所述二氧化硅濃縮劑的水性溶 液進一步含有陽離子鹽，優(yōu)選CaCl2。12. 根據(jù)前述權(quán)利要求8-11中任一項所述的方法，其中所述二氧化硅前體選自由以 下各項組成的組：聚硅酸（H2Si03)n、三甲氧基甲基硅烷、二甲氧基二甲基硅烷、有機改性硅 酸鹽（有機改性二氧化硅）、四甲氧基硅烷（TMOS)、四乙氧基硅烷（TEOS)、二甘油基硅烷 (DGS)和硅酸鈉（N2Si03)或它們的混合物。13. 根據(jù)前述權(quán)利要求8-12中任一項所述的方法，其中所述二氧化硅前體的濃度介于 0. 1M和2M之間。14. 根據(jù)前述權(quán)利要求8-13中任一項所述的方法，其中將選自由二氧化硅膠體二氧化 硅共前體或二氧化硅的納米粒子組成的組中的添加劑加入到所述二氧化硅前體溶液中。15. 根據(jù)前述權(quán)利要求1-7中任一項所述的珠?；蛘咄ㄟ^根據(jù)前述權(quán)利要求8-14中任 一項所述的方法獲得的珠粒在以下各項中的用途： -在用于生產(chǎn)感興趣的分子的生物反應(yīng)器中， -在包括人的動物的活體器官內(nèi)遞送感興趣的分子中，或 -在純化和/或分離方法和設(shè)備中，優(yōu)選在色譜柱中。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有毫米級尺寸的適用于包載組分或生物活性物質(zhì)的混雜二氧化硅珠粒，其中該珠粒由多孔核以及包含二氧化硅和二氧化硅濃縮劑(2)的外部多孔層形成，該多孔核由混雜藻酸鹽-二氧化硅(1)構(gòu)成。本發(fā)明還涉及制備這些混雜珠粒的一鍋工藝，并且涉及根據(jù)本發(fā)明的珠粒的用途。
【IPC分類】C12P3/00, B01J13/14, B01J2/08, C12N11/10, C12N11/04
【公開號】CN105324484
【申請?zhí)枴緾N201480035726
【發(fā)明人】喬納森·德斯梅特, 克里斯托夫·默尼爾, 巴奧-利安·蘇
【申請人】那慕爾大學(xué)
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2014年6月17日
【公告號】CA2917546A1, EP3013954A1, US20160143857, WO2014206819A1