色原酮類衍生物和作為熒光染料的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一類新的色原酮類衍生物、其制備方法及其作為熒光染料的用途，如 生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 熒光分子是指吸收某一波長的光波后能發(fā)射出大于吸收光波長的物質(zhì)，熒光分子 化合物通常含有苯環(huán)或共軛雜環(huán)體系。熒光分子可用于活細(xì)胞成像、分子探針的合成、核酸 研究、高通量篩選、疾病診斷。由于熒光染料靈敏度高，操作方便，因而其廣泛應(yīng)用于熒光免 疫，熒光探針，細(xì)胞染色及活體染色等。因此被廣泛應(yīng)用在生命科學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、信息科學(xué)和 環(huán)境科學(xué)等方面。隨著應(yīng)用范圍越來越廣泛，熒光染料的研究發(fā)展迅速且受到了更多的重 視。
[0003] 已有的熒光染料已基本覆蓋了由紫外到可見光及紅外的整個(gè)光譜范圍。盡管對于 熒光染料的需要越來越多，但是目前的熒光分子種類并不是很多，主要包括以下幾大種類： 氧雜蒽類（羅丹明、熒光素），萘類（丹磺酰氯），香豆素類（7-氨基-4-甲基香豆素），蒽 類（蒽醌），芘類，噁嗪類（尼羅紅、尼羅藍(lán)），吖啶類（原黃素），四吡咯（卟啉）。其中普 遍用于生物學(xué)研究的熒光染料主要是羅丹明類，熒光素類，丹磺酰氯和香豆素類。各種熒光 分子的母核決定其具有不同的物理及化學(xué)性質(zhì)，所以不同的熒光分子適合不同的生物研究 環(huán)境。目前的熒光分子均具有一些不足之處，所以，制備發(fā)現(xiàn)不同母核的熒光分子具有重大 的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本專利中制備的熒光分子化合物在生物緩沖液中（pH>5)時(shí)能夠釋放出很強(qiáng)的熒 光，可以廣泛地用于生命科學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、疾病診斷與環(huán)境科學(xué)中。這類熒光分子可以用來 標(biāo)記蛋白或抗體，用于蛋白或抗體的組織或細(xì)胞的免疫成像；可以作為熒光標(biāo)簽與活性化 合物設(shè)計(jì)成分子探針，用于活細(xì)胞的細(xì)胞成像以及相互作用蛋白的鑒定研究；可以作為熒 光標(biāo)簽，用于生物化學(xué)篩選中，如酶活性、蛋白相互作用、生物大分子的相互作用的定量定 性篩選；可以作為熒光標(biāo)簽，用于臨床檢測試劑盒的設(shè)計(jì)中；可以設(shè)計(jì)成熒光探針，用于環(huán) 境監(jiān)測，如苯硫污染水源。
[0005] 具體而言，本發(fā)明包括式I所示的化合物或其鹽：
[0006]
[0007] &獨(dú)立地選自1-6個(gè)碳的烷基、2-6個(gè)碳的烯基、2-6個(gè)碳的炔基或任選地被1-4 個(gè)R3基團(tuán)取代的1-6個(gè)碳的烷基、2-6個(gè)碳的烯基、炔基；
[0008] 在每種情況下，r3獨(dú)立地選自or4、NR4R5、羧基、醛基、疊氮基、鹵素、順丁烯二酰亞 胺、酰肼、羥氨、巰基、三氮唑、生物素、苯環(huán)或任選地被1-5個(gè)R6基團(tuán)取代的苯環(huán)；
[0009] 1?4和1?5獨(dú)立地選自H、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)基和雜 芳基；
[0010] R6獨(dú)立地選自〇R4、NR4R5、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、竣基、1*基、置 氮基、鹵素、酰肼、羥氨、巰基、三氮唑、生物素；
[0011] η是0或1;
[0012] η= 0時(shí)，R2選自C3-6環(huán)烷基或3-8元飽和的或部分飽和的雜環(huán)，其中雜環(huán)可任 選地被取代并且其含有0-2個(gè)選自N、0和S的其它雜原子；
[0013] η= 1時(shí)，R2選自1-6個(gè)碳的烷基、2-6個(gè)碳的烯基、炔基或任選地被1-4個(gè)R3基 團(tuán)取代的1-6個(gè)碳的烷基、2-6個(gè)碳的烯基、炔基；R3獨(dú)立地選自0R4、NR4R5、羧基、醛基、疊 氮基、鹵素、順丁烯二酰亞胺、酰肼、羥氨、巰基、三氮唑、生物素、苯環(huán)或任選地被1-5個(gè)R6 基團(tuán)取代的苯環(huán)；R4和馬獨(dú)立地選自Η、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜 環(huán)基和雜芳基；1?6獨(dú)立地選自0R4、NR4R5、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、竣基、酉全 基、疊氮基、鹵素、酰肼、羥氨、巰基、三氮唑、生物素。
[0014] 優(yōu)選的通式I所示的化合物，包括但不限定于，如通式IA所示的化合物
[0015]
[0016] 其中：
[0017] η是0或1;
[0018] η= 0時(shí)，R2選自C3-6環(huán)烷基或3-8元飽和的或部分飽和的雜環(huán)，其中雜環(huán)可任 選地被取代并且其含有0-2個(gè)選自N、0和S的雜原子；
[0019] η= 1時(shí)，R2選自1-6個(gè)碳的烷基、2-6個(gè)碳的烯基、炔基或任選地被1-4個(gè)R3基 團(tuán)取代的1-6個(gè)碳的烷基、2-6個(gè)碳的烯基、炔基；R3獨(dú)立地選自0R4、NR4R5、羧基、醛基、疊氮 基、鹵素、順丁烯二酰亞胺、酰肼、羥氨、巰基、三氮唑、苯環(huán)或任選地被1-5個(gè)R6基團(tuán)取代的 苯環(huán)、生物素；
[0020] 1?4和R5獨(dú)立地選自H、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)基和雜 芳基；Re獨(dú)立地選自O(shè)R4、NR4R5、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、竣基、酸基、置氣 基、鹵素、酰肼、羥氨、巰基、三氮唑、生物素。
[0021] 優(yōu)選的通式I所示的化合物，包括但不限定于，如通式IB所示的化合物
[0022]
[0023] 其中：
[0024] &獨(dú)立地選自2-6個(gè)碳的烷基、2-6個(gè)碳的烯、炔基或任選地被1-4個(gè)R3基團(tuán)取代 的1-6個(gè)碳的烷基、2-6個(gè)碳的烯、炔基；
[0025] 在每種情況下，R3獨(dú)立地選自0R4、NR4R5、羧基、醛基、疊氮基、鹵素、順丁烯二酰亞 胺、酰肼、羥氨、巰基、三氮唑、苯環(huán)或任選地被1-5個(gè)R6基團(tuán)取代的苯環(huán)、生物素；
[0026] 1?4和R5獨(dú)立地選自H、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)基和雜 芳基；
[0027] R6獨(dú)立地選自〇R4、NR4R5、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、竣基、輕基、置 氮基、鹵素、酰肼、羥氨、巰基、三氮唑、生物素；
[0028] m是0、1、2或3。
[0029] 最優(yōu)選的化合物選自如下群組：
[0030]


[0033] 本發(fā)明還公開了本發(fā)明化合物色原酮結(jié)構(gòu)的合成方法：
[0034]
[0035] 氬氣保護(hù)下，將三氟化硼乙醚溶液（2mL)緩慢滴入試劑I(leq，5mm〇l)，試劑 II(leq, 5mmol)的混合物中，油浴加熱110°C，兩小時(shí)后，薄層層析板檢測原料反應(yīng)完全，移 至室溫，緩慢滴入甲磺酰氯（1.2mL)，二甲基甲酰胺（2. 5mL)溶液，滴畢后，移至油浴加熱回 流3-5小時(shí)，薄層層析板檢測反應(yīng)完全。將反應(yīng)液傾入冰水中，乙酸乙酯萃取、飽和氯化鈉 溶液洗滌、硫酸鈉干燥，蒸出溶劑。硅膠柱層析分離最終產(chǎn)物，二氯甲烷：甲醇=100:1。
[0036] 本發(fā)明首先通過測定本發(fā)明色原酮衍生物光物理常數(shù)（包括但不限定于：摩爾消 光系數(shù)與最大吸收波長、最大熒光激發(fā)波長和熒光吸收波長、以及熒光量子產(chǎn)率）對本專 利中熒光分子的光物理性能進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的熒光分子在生命科學(xué)領(lǐng)域與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué) 領(lǐng)域具有應(yīng)用前景。
[0037] 研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的熒光分子具有pH依賴的熒光強(qiáng)度。隨著pH的增加，本發(fā)明熒光 分子顯示出pH依賴的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。在pH5-8的緩沖溶液中，其顯示出的中等熒光強(qiáng)度， 這種熒光強(qiáng)度已經(jīng)足以滿足各類生物試驗(yàn)的要求。當(dāng)pH大于8時(shí)，該類熒光分子顯示出非 常強(qiáng)的熒光量子產(chǎn)率與熒光強(qiáng)度。
[0038] 本發(fā)明的熒光分子在黑白相機(jī)下顯示出非常強(qiáng)烈的光亮度。在黑白相機(jī)下，本發(fā) 明的熒光分子較商業(yè)熒光對照化合物7-氨基-4-甲基香豆素（AMC)顯示出更加明顯的熒 光亮度?？紤]到黑白相機(jī)在生物成像（熒光顯微鏡）中的廣泛應(yīng)用，這更加有利于本專利 中的熒光分子在生物成像中的應(yīng)用。
[0039] 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的熒光分子能用于熒光成像來檢測目標(biāo)化合物在細(xì)胞 內(nèi)分布。首先，將目標(biāo)化合物（含有能夠與熒光分子反應(yīng)的基團(tuán)，如炔基）與細(xì)胞共同孵育， 從而使目標(biāo)化合物特異定位于細(xì)胞內(nèi)，之后將細(xì)胞固定。采用熒光分子（含有反應(yīng)基團(tuán)，如 疊氮基團(tuán)），通過化學(xué)反應(yīng)方法（如點(diǎn)擊化學(xué)）將熒光分子與目標(biāo)化合物連接到一起形成穩(wěn) 定的化學(xué)鍵（如三氮唑類結(jié)構(gòu)）。之后用0. 1MTris-HCl，pH8. 0的緩沖液洗掉沒有反應(yīng)的 熒光分子，在倒置顯微鏡下觀察到部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)藍(lán)色熒光，也即熒光分子能夠特異性的 標(biāo)記目標(biāo)化合物。
[0040] 本發(fā)明的熒光分子能用于組織樣品的熒光成像來檢測目標(biāo)化合物在組織細(xì)胞內(nèi) 的分布。組織樣品的熒光染色對于熒光染料的要求較高，這是因?yàn)榻M織樣品通常對于熒光 染料有非特異性的吸附，所以需要熒光染料具有非常強(qiáng)烈的亮度。腫瘤組織的石蠟切片脫 蠟后和本發(fā)明的熒光染料通過化學(xué)反應(yīng)標(biāo)記組織細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)化合物，洗去沒有反應(yīng)的熒 光染料后在正置熒光顯微鏡觀察，到腫瘤組織中細(xì)胞器結(jié)構(gòu)是顯示染藍(lán)色熒光，說明本發(fā) 明的熒光分子能用于組織的熒光成像。
【附圖說明】
[0041] 圖1，不同pH值下熒光分子IA-1的熒光
[0042] 圖2,本專利中熒光分子IA-1到IA-5與異黃酮類天然產(chǎn)物及商業(yè)染料AMC在黑白 相機(jī)中的成像的比較。第1行的三個(gè)孔分別為異黃酮類天然產(chǎn)物（大豆素、芒柄花黃素和 黃豆黃素）；第2孔第1孔為商業(yè)染料7-氨基-4甲基香豆素（AMC)，第3行5個(gè)孔為本專 利中的熒光分子IA-1到IA-5。
[0043] 圖3,熒光分子IA-5特異性標(biāo)記細(xì)胞核DNA中的EdU，即細(xì)胞核特異性熒光染色
[0044] 圖4,采用熒光染料IA-5標(biāo)記腫瘤組織細(xì)胞核DNA中插入的EdU。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 下面通過實(shí)施例來說明本專利的可實(shí)施性，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，根據(jù)現(xiàn) 有技術(shù)的指導(dǎo)，對相應(yīng)技術(shù)特征進(jìn)行修改或替換，仍然屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0046] 實(shí)施例
[0047] 色原酮結(jié)構(gòu)的合成通法，實(shí)施例中所列舉的化合物中色原酮結(jié)構(gòu)均參照下述操作 合成：
[0048]
[0049] 氬氣保護(hù)下，將三氟化硼乙醚溶液（2mL)緩慢滴入試劑I(leq，5mm〇l)，試劑 II(leq，5mmol)的混合物中，油浴加熱110°C，兩小時(shí)后，薄層層析板監(jiān)測原料試劑反應(yīng)完 全，移至室溫，緩慢滴入甲磺酰氯（1.2mL)，二甲基甲酰胺（2. 5mL)溶液，滴畢后，移至油浴 加熱回流3-5小時(shí)，薄層層析板監(jiān)測反應(yīng)完全。將反應(yīng)液傾入冰水中，乙酸乙酯萃取、飽和 氯化鈉溶液洗滌、硫酸鈉干燥，蒸出溶劑。硅膠柱層析分離最終產(chǎn)物，二氯甲烷：甲醇= 100:1〇
[0050] 本專利中個(gè)別化合物是在已經(jīng)制備的色原酮類似物的基礎(chǔ)上進(jìn)一步修飾，詳見具 體的實(shí)施例。
[0051] 實(shí)施例1 :3- 丁基-7-羥基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮化合物（IA-1)
[0052]
[0053] 以4-甲氧基-1，3-苯二酚、正己酸為原料，按照合成通法的操作，制備得白色 固體 434mg。4NMR(400MHz，DMS0)δ= 10. 49 (s，1H)，8. 07 (s，1H)，7. 36 (s，1H)，6. 89 ( s，1Η)，3·86(s，3Η)，2· 34 (t，J= 7. 5Hz，2Η)，1· 56-1. 41 (m，2Η)，1· 36-1. 19 (m，2Η)，0· 89 (t，J= 7.3Hz，3H);13CNMR(101MHz，CDCl3)S= 180.77，157.90，157.33