一種含有鯽魚(yú)ifn干擾素的藍(lán)藻工程菌及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種含有娜魚(yú)IFN干擾素的藍(lán)藻工程菌及應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖期間病害亦越來(lái)越嚴(yán)重。大量、盲目使用抗生 素和化學(xué)合成藥物不但防治效果差，而且還造成一系列不良后果。因此，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者 從免疫學(xué)角度開(kāi)展水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治研究，通過(guò)給水產(chǎn)動(dòng)物服用免疫添加劑來(lái)提高動(dòng)物體 的特異性和非特異性免疫機(jī)能，從而提高其抗病能力（朱小明，2005)。干擾素系統(tǒng)是機(jī)體 對(duì)抗病毒感染的一道重要防御系統(tǒng)，它與細(xì)胞免疫、體液免疫及其他非特異性免疫協(xié)同作 用抵抗病毒的侵染。在干擾素系統(tǒng)中產(chǎn)生的干擾素是一種廣譜抗病毒劑，其作用是通過(guò)對(duì) 細(xì)胞表面受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，抑制病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制。還可增強(qiáng)自然 殺傷細(xì)胞、巨隧細(xì)胞和T淋己細(xì)胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)抗病毒能力，在一 定程度上還影響細(xì)胞生長(zhǎng)和分化等多種生物活性。魚(yú)類(lèi)干擾素同樣具有廣譜的抗病毒功 能，研究表明其能夠誘導(dǎo)大量抗病毒基因的表達(dá)，包括其本身，形成一個(gè)正反饋?zhàn)饔茫瑥亩?保護(hù)機(jī)體避免病毒感染致死。
[0003] 重組干擾素作為一種蛋白質(zhì)多膚類(lèi)藥物成功應(yīng)用于人類(lèi)和一些動(dòng)物病毒病的防 治。魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)使用重組干擾素防治疾病發(fā)生的方法思路有Ξ種，即注射、浸浴和口服。運(yùn) 些方法的初步應(yīng)用研究表明所用防治方法不同，療效差異較大：僅注射免疫方式使魚(yú)獲得 一定的免疫保護(hù)，而拌料投喂（口服）和浸浴兩種免疫方式未顯示出免疫保護(hù)效果。然而， 在養(yǎng)殖實(shí)踐中注射免疫過(guò)于耗時(shí)耗力，如何減少重組干擾素在消化道吸收過(guò)程中的損耗， 使更為便利和實(shí)用的投喂方式也同樣發(fā)揮作用？運(yùn)是對(duì)于養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)病毒病防治具有實(shí)用 價(jià)值的問(wèn)題。
[0004] 藍(lán)藻，作為高檔水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的飼料或飼料添加劑早已被廣泛應(yīng)用。藍(lán)藻 SynechococcUSSP.PCC7002作為一種能夠光合自養(yǎng)的微生物，其低廉的培養(yǎng)成本，高效 的生長(zhǎng)速率W及特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，為其作為產(chǎn)生干擾素化IFN的工程菌提供了很大潛力。 此外藍(lán)藻Synechococcussp.PCC7002的全基因組測(cè)序與功能注釋已經(jīng)完成，分子和遺傳 學(xué)操作十分方便；使得在藍(lán)藻Synechococcussp.PCC7002中表達(dá)外源的干擾素化IFN基 因成為可能。本發(fā)明使用轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻作為飼料添加劑加入魚(yú)飼料中，減少了干擾素在投喂 過(guò)程中W及消化道中的損耗，實(shí)現(xiàn)了使用投喂的方式即能達(dá)到提高免疫保護(hù)效果的目的， 同時(shí)運(yùn)種方法比注射免疫更為便利，適用于魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)。因此，將轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻作為飼料添加 劑添加到魚(yú)飼料中，通過(guò)其中的干擾素來(lái)提高動(dòng)物體的免疫機(jī)能，從而提高其抗病能力，為 開(kāi)發(fā)安全的免疫增強(qiáng)型飼料提供一種解決方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供含有娜魚(yú)IFN干擾素的藍(lán)藻工程菌，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將娜 IFN(CalFN)基因克隆至藍(lán)藻中，即可得到一種分泌干擾素的藍(lán)藻工程菌。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供含有娜魚(yú)IFN干擾素的藍(lán)藻工程菌的應(yīng)用。該基因 工程菌可作為魚(yú)飼料的添加劑，通過(guò)其中的干擾素來(lái)提高動(dòng)物體的免疫機(jī)能，從而提高其 抗病能力。
[0007] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了一種含有娜魚(yú)IFN干擾素的藍(lán)藻工程菌的魚(yú)飼 料，飼料配方合理，該種飼料配方含有魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)所需的各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)及元素，滿(mǎn)足魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)所 需，同時(shí)加入了含有干擾素化IFN的藍(lán)藻，運(yùn)些原料充分混勻后經(jīng)飼料機(jī)做成大小合適的 飼料顆粒，方便投喂，減小干擾素在投喂過(guò)程中的消耗，也保護(hù)干擾素有效進(jìn)入魚(yú)體發(fā)揮免 疫保護(hù)效果。
[0008] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)措施：
[0009] 含有娜魚(yú)IFN干擾素的藍(lán)藻工程菌，為將SEQIDNO. 1所示基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方 法轉(zhuǎn)入藍(lán)藻中得到。
[0010] 優(yōu)選的，通過(guò)W下步驟獲得：
[0011] 1、從娜魚(yú)中擴(kuò)增目的基因CaIFN(SEQIDNO. 1所示），將目的基因與T載體連接轉(zhuǎn) 化大腸菌，得到陽(yáng)性重組質(zhì)?；疘FN-T。
[0012] 2、采用雙酶切的方法，將目的基因從質(zhì)?；疘FN-T上切下與含有同樣酶切位點(diǎn)的 質(zhì)粒pAEQ19(Dong}dXu2005;PlantPhysiology,July2005,Vol. 138,PP. 1586 - 1595)連 接，得到重組質(zhì)粒質(zhì)粒化IFN-PAEQ19。
[001引 3、利用常規(guī)方式將化IFN-pAEQ19轉(zhuǎn)入藍(lán)藻Synechococcussp.PCC7002中，經(jīng)PC R檢測(cè)，獲得轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻。
[0014] 含有娜魚(yú)IFN干擾素的藍(lán)藻工程菌的應(yīng)用，包括利用該轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻用于魚(yú)飼料的 添加劑。將含有干擾素化IFN的藍(lán)藻工程菌冷凍干燥后制成轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻藻粉，按1 %~3% 的劑量添加進(jìn)魚(yú)飼料中。
[0015] 一種含有干擾素化IFN的藍(lán)藻工程菌的魚(yú)飼料，包括：
[0016] 組分 董量傲 魚(yú)粉 40-訊 奸粉 五-8 藍(lán)藻 1-4 α-淀粉 15
[0017] 玉米淀粉 15-20 魚(yú)油 0 5-3 乂豆油 0.5-3 維生素預(yù)混料 0.1-().5 膽堿 0.1-0.5 礦物雜預(yù)混料 1-2 二水憐酸二氨軸1-2 憐酸二氨鐘 ！-3 二水構(gòu)酸氨巧 0.5-1.5 纖維素 5-i0 猿甲基纖維案 1-5 海藻酸鋼 1-5
[0018] 所述的藍(lán)藻為一種分泌干擾素化IFN的轉(zhuǎn)基因，通過(guò)將化IFN基因克隆至藍(lán)藻中 獲得。一種含有干擾素化IFN的藍(lán)藻工程菌的魚(yú)飼料，包括W下配方（最佳配比）：
[0019] 組分 重量份 魚(yú)粉 45.00 化粉 5.00 藍(lán)藻 2.00 α-淀粉 10.00 玉米淀粉 17.00 魚(yú)油 LOO 大豆油 1.00 維生素預(yù)混料 0.巧 腥堿 0.11 礦物鹽預(yù)混料 二水靖酸二氨鋼1.25 構(gòu)酸二氨巧 L60 二水憐酸氨媽 0.77 巧維素 7.50 媛甲基纖維'素 3.00
[0020] 海藻繼銷(xiāo) 3胤；
[0021] 優(yōu)選的，所述的維生素預(yù)混料，按1kg計(jì)，包括：維生素A0. 469g，維生素D 0. 128g，維生素E2. 564g，維生素K2. 564g，煙酸 25. 641g，核黃素 5. 128g，化唉醇 5. 128g， 硫胺5. 128g，泛酸巧12. 821g，生物素0. 026g，葉酸1. 282g，維生素B12 5. 128g，抗壞血酸 25. 641g，肌醇 25. 641g，麥教粉 882. 711g;
[0022] 所述的礦物質(zhì)預(yù)混料，按1kg計(jì)，包括：氯化鋼36. 232g，硫酸儀543. 478g，硫酸鐵 90. 580g，乳酸巧126. 812g，硫酸鋒12. 790g，硫酸儘5. 870g，硫酸銅1. 123g，硫酸鉆0. 036邑， 艦化鐘0. 109g，淀粉16. 304g，沸石粉166.666邑。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0024] 1、藍(lán)藻Synechococcussp.PCC7002是天然的感受態(tài)，一般不經(jīng)過(guò)任何處理，即可 直接用于轉(zhuǎn)化外源DNA。方便進(jìn)行基因改造，使其成為生產(chǎn)干擾素化IFN的工程菌。此外其 低廉的培養(yǎng)成本，高效的生長(zhǎng)速率使得生產(chǎn)成本大為下降。
[00巧]2、藍(lán)藻富含蛋白質(zhì)、多糖、不飽和脂肪酸和細(xì)胞色素等多種重要的生命活性物質(zhì)， 作為高檔水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的飼料或飼料添加劑早已被廣泛應(yīng)用，是一種天然的理想的無(wú)公害 飼料添加劑。該種飼料配方含有轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻，及魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)所需的各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)及元素，滿(mǎn)足魚(yú)類(lèi) 的生長(zhǎng)所需，利用含有干擾素的藍(lán)藻作為飼料添加劑，減少了干擾素在投喂過(guò)程中W及消 化道中的損耗，實(shí)現(xiàn)了使用投喂的方式即能達(dá)到提高免疫保護(hù)效果的目的，同時(shí)運(yùn)種方法 比注射免疫更為便利，適用于魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)。因而通過(guò)改造藍(lán)藻作為干擾素添加劑的載體，不 僅能使其高效表達(dá)干擾素化IFN來(lái)提高動(dòng)物體的免疫機(jī)能，增強(qiáng)抗病能力，有效的減少抗 生素和化學(xué)合成藥物的使用，藍(lán)藻本身也富含蛋白質(zhì)、多糖、不飽和脂肪酸和細(xì)胞色素等多 種重要的生命活性物質(zhì)，是一種理想的魚(yú)類(lèi)巧料，運(yùn)兩者的結(jié)合有助于提高水產(chǎn)產(chǎn)品的品 質(zhì)和產(chǎn)量。
[0026] 3.現(xiàn)有技術(shù)表明很多投喂方式添加干擾素不能顯示出免疫作用，只有注射能夠達(dá) 到干擾素的效果，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，通過(guò)藍(lán)藻作為載體對(duì)干擾素進(jìn)行表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了投喂也可 有效的目的。
【具體實(shí)施方式】
[0027]本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案，所述試劑如未特別 說(shuō)明，均購(gòu)自商業(yè)渠道。
[0028] 實(shí)施例1:
[0029] 轉(zhuǎn)基因CalFN藍(lán)藻的獲得
[0030] 對(duì)野生型娜魚(yú)取肝臟，于液氮中速凍娠磨成粉末狀。加入1mlTrizol充分混 勻，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA庫(kù)，對(duì)i化的0RF區(qū)域設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)NdeI和BamHI 的引物AIgae-CalFN-F:ATCGCATATGATGAAAACTCAAATGTGG，Algae-CaIFN-R2:ATCGGGA TCCTTATCGTCTGTTGGCAAT進(jìn)行PCR擴(kuò)增。核酸凝膠電泳后通過(guò)膠回收得到DM片段，與載體 PAEQ19分別進(jìn)行酶切，進(jìn)行凝膠電泳再次回收DNA片段，16°C連接3小時(shí)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 D冊(cè)α，挑取陽(yáng)性克隆。轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒。同時(shí)通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證序列正確。
[0031] 引物序列如下：
[0032]Algae-CaIFN-FATCGCATATGATGAAAACTCAAATGTGG
[0033]Algae-CaIFN-R2ATCGGGATCCTTATCGTCTGTTGGCAAT
[0034]取培養(yǎng)的600ul聚球藻PC7002 (0D550nm值為0. 19)，6000r/min離屯、2min，棄 400ul上清液，加入制備好的質(zhì)粒lOul，輕輕混勻，遮光靜置4-8小時(shí)。將藻液均勻涂在A+ 固體培養(yǎng)基上，靜置12-14小時(shí)，倒Topagar(；5mlTopagar包含鏈霉素35ul(lOmg/ml))。 靜置培養(yǎng)15天左右。
[003引從A+固體培養(yǎng)基上挑選出單菌落，繼續(xù)在已加入鏈霉素抗性的A+固體培養(yǎng)基上 培養(yǎng)，劃線(xiàn)分離重復(fù)Ξ代，從最后一次的培養(yǎng)基上挑選單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0036] 檢測(cè)轉(zhuǎn)化的聚球藻P(X7002。采用PCR方法檢測(cè)（邢州等，2009)。吸取野生型和轉(zhuǎn) 化型的聚球藻PCC7002的藻液150ul，6000;r/min離屯、Imin，吸棄上清液，加入50ul無(wú)菌水 和20U1玻璃珠，使用Vodex振蕩Imin，吸取上清液，并W此為模板，引物Algae-化IFN-F/ Algae-CaIFN-R2擴(kuò)增目的基因約0. 5化長(zhǎng)短的片段，產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，獲得轉(zhuǎn)入外源基 因CalFN的轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻。
[0037] 野生型聚球藻7002使用的培養(yǎng)基是A+培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻使用的培養(yǎng)基是A+培 養(yǎng)基中添加抗生素鏈霉素，添加濃度為100μg/mL。野生型聚球藻7002和轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻在平 板上生長(zhǎng)時(shí)使用的是固體培養(yǎng)基，其他時(shí)候使用的是液體培養(yǎng)基。
[003引 A+液體培養(yǎng)基如下：
[0039]
[0040]

[0041] 補(bǔ)充說(shuō)明:標(biāo)的為事先單獨(dú)滅菌然后在超凈臺(tái)加的組分。固體培養(yǎng)基配方為 在上述的液體培養(yǎng)基中添加1. 5%的瓊脂粉。
[0042] 轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻化IFN基因的表達(dá)活性的驗(yàn)證：
[004引總蛋白提取
[0044] 1.在藍(lán)藻Synechococcussp.P