一種發(fā)酵高產dha的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，設及裂殖壺菌菌種的馴化W及利用馴化的菌種進行 DHA生產的方法。
【背景技術】
[0002] 二十二碳六締酸（22:6n-3)，簡稱DHA，是ω-3系列中一種重要的多不飽和脂肪酸 (polyunsaturatedfattyacid,PUFA)eDHA不僅是嬰幼兒大腦、視覺正常發(fā)育的必需物質， 而且還具有延緩老年人大腦和視覺功能衰退和降低血脂、抑制血栓生成、抗自身免疫反應、 抑制腫瘤等功效，因此被譽為"腦黃金"。目前，DHA已廣泛用于嬰幼兒食品、保健食品和輔 助治療劑等產品。
[000引 目前，傳統(tǒng)魚油來源的DHA油脂由于易受環(huán)境、季節(jié)等的影響，導致DHA產量有限； 而且，魚油具有膽固醇和其它不飽和脂肪酸含量高，分離純化困難的缺點。因此，利用微生 物發(fā)酵制備DHA油脂越來越受到關注。能夠合成DHA的微生物主要是一些低等海洋真菌和 微藻，如破囊壺菌、裂殖壺菌、隱甲藻等。而裂殖壺菌（Schizochytriumsp.)作為海洋真菌， 因其具有發(fā)酵周期短，生產DHA油脂能力強等的優(yōu)點，而成為當前微生物發(fā)酵產DHA的常用 菌種。裂殖壺菌合成的脂肪酸組分較為單一，總脂含量達20%，其中DHA占45%左右，其它 不飽和脂肪酸百分率小于1%，因此利用裂殖壺菌生產DHA具有廣大的市場前景。
[0004] 目前，關于微生物發(fā)酵產DHA的現(xiàn)有技術主要包括兩個方面：1、DHA生產菌株的誘 變篩選方法，如中國海洋大學的（海洋真菌裂殖壺菌0UC88的工業(yè)應用）（中國專利申請CN 200410075426.訝；南京工業(yè)大學的一種二十二碳六締酸生產菌株及其誘變篩選方法及其 應用（中國專利申請CN200910033493.8)等；2、關于培養(yǎng)基的組成，如南京工業(yè)大學的一 種裂殖壺菌及利用其生產DHA油脂的方法（200910033869.5)等。傳統(tǒng)的發(fā)酵調控過程難 W穩(wěn)定控制，并且發(fā)酵調控主要針對油脂含量的提高，沒有從根本上提高DHA含量。而菌種 的傳統(tǒng)改造主要都通過誘變篩選的方法，此方法由于缺乏針對高DHA含量菌種的篩選培養(yǎng) 基，造成篩選工作盲目，因此，菌種篩選工作量較大，而篩選效果卻往往不夠理想。因此新的 菌種選育方法，對提高裂殖壺菌中DHA含量具有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0005] 針對現(xiàn)有方法中，菌種選育過程相對盲目的技術問題。本發(fā)明通過提供一種馴化 裂殖壺菌的方法，來實現(xiàn)DHA的高產。
[0006] 具體的，本發(fā)明的技術方案為：
[0007] 一種馴化裂殖壺菌菌種的方法，其中，在馴化培養(yǎng)基中添加了強氧化劑。本發(fā)明 中，可W理解為，馴化裂殖壺菌的方法通過將裂殖壺菌在含有強氧化劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)馴 化實現(xiàn)。
[000引本發(fā)明所述的方法，其中，所述馴化培養(yǎng)基配方包括碳源、氮源、無機鹽離子和微 量元素；其中，碳源為葡萄糖；氮源為酵母粉；無機鹽離子為鋼鹽、儀鹽、鐘鹽、憐酸鹽和巧 鹽中的任意一種或多種；微量元素為Mn2\Co2\Ni2+和化2+中的任意一種或多種。
[0009] 本發(fā)明所述的方法，其中，馴化的具體步驟為：
[0010] (1)在活化培養(yǎng)基中活化菌種； 1] 似在添加強氧化劑的馴化培養(yǎng)基中，接種經活化的菌種，培養(yǎng)生長至馴化培養(yǎng)體 系中的細胞干重達到25g/L;
[0012] (3)將步驟（2)得到的馴化菌種接入不含強氧化劑的種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)生長至 體系中的細胞干重達到25g/L;
[0013] (4)提高馴化培養(yǎng)中強氧化劑的濃度，接種經步驟（3)得到的馴化菌種，培養(yǎng)生長 至馴化培養(yǎng)體系中的細胞干重達到25g/L;
[0014](5)循環(huán)步驟（2)、（3)和步驟（4)，直至馴化菌種能夠在含有強氧化劑質量濃度為 0. 1 %的馴化培養(yǎng)基中正常生長至細胞干重25g/L。
[0015]本發(fā)明所述的方法，其中，循環(huán)步驟（2)、（3)和步驟（4)的次數(shù)為2次W上。對于 該循環(huán)此次的定義，應理解為，每循環(huán)操作培養(yǎng)一次，馴化培養(yǎng)基中強氧化劑的濃度提高一 次，直至到最高的強氧化劑濃度。優(yōu)選為3次，4次，5次，6次。
[0016] 本發(fā)明所述的方法，其中，步驟似中第一次添加強氧化劑的初始質量濃度含量 為 0.01%。
[0017] 本發(fā)明所述的方法，其中，步驟（4)所述循環(huán)步驟中，強氧化劑的質量濃度優(yōu)選依 次控制為：〇. 02%，0. 03%，0. 04%，0. 05%，0. 06%，0. 07%，0. 08%，0. 09%，0. 1%。
[001引本發(fā)明所述的方法，其中，步驟似、（3)和步驟（4)中，所述接種的接種量為培養(yǎng) 基體積的0.2~2%。
[0019] 本發(fā)明所述的方法，其中，所述強氧化劑為高儘酸鐘或過氧化氨。
[0020] 本發(fā)明所述的方法，其中，所述強氧化劑的除菌方式為膜過濾。其中膜過濾的方式 即為，將強氧化劑配制為相應濃度要求的溶液，然后通過膜過濾可W去除污染細菌，使得過 濾后的溶液符合裂殖壺菌培養(yǎng)的要求。
[0021] 一種發(fā)酵高產DHA的方法，其中，采用上述任一權利所述方法獲得的菌株進行DHA 發(fā)酵、提取，獲得含DHA的油脂。目P，利用馴化的菌種進行擴大培養(yǎng)發(fā)酵，最終獲得裂殖壺菌 菌體，并提取油脂。對于菌株的選擇，可W是能夠耐受質量含量0. 1%強氧化劑且在培養(yǎng)時， 生長細胞干重已經超過25g/L的菌株；也可W是耐受更低強氧化劑質量含量濃度的菌株。
[0022] 更進一步的，在一個整體優(yōu)選的方案中，方法包括如下步驟：
[0023] (1)將裂殖壺菌菌種的活化
[0024] (2)在強氧化劑質量濃度為0. 01%的過氧化氨溶液的馴化培養(yǎng)基中，接入活化后 的裂殖壺菌菌種；馴化數(shù)天，待裂殖壺菌生物量生長至25g/lW上。
[00巧](3)將步驟（2)獲得的菌種接入不含強氧化劑的種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)生長至體系 中的細胞干重達到25g/L;
[00%] (4)將步驟（3)獲得的菌種接入強氧化劑質量濃度為0. 02 %的過氧化氨溶液的馴 化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)生長至體系中的細胞干重達到25g/L;
[0027] (5)如此不斷逐步提高強氧化劑添加濃度，重復2, 3步驟長期馴化，直到馴化菌種 能夠在含有0. 1%強氧化劑培養(yǎng)基中正常生長，其中，馴化培養(yǎng)基中的強氧化劑濃度依次控 制為 0. 03%，0. 04%，0. 05%，0. 06%，0. 07%，0. 08%，0. 09%，0. 1%。。
[0028] (6)利用能夠耐受質量含量0.1%強氧化劑且在培養(yǎng)時，生長細胞干重已經超過 25g/L的菌株進行擴大培養(yǎng)發(fā)酵，最終獲得裂殖壺菌菌體，并提取油脂。
[0029] 步驟（1)中，原始菌種的活化方法為：將具有合成DHA能力的微生物接種于種子 培養(yǎng)基中，25Γ培養(yǎng)24小時，待種子生長至對數(shù)期。其中，所述的種子培養(yǎng)基包括碳源、氮 源、無機鹽離子和微量元素，其中碳源為葡萄糖，氮源為酵母粉，無機鹽離子為鋼鹽、儀鹽、 鐘鹽、憐酸鹽和巧鹽中的任意一種或多種，微量元素為Mn2\Co2\Ni2+和化2+中的任意一種 或多種。
[0030] 步驟似中，將活化的種子接入含有0. 02 %強氧化劑培養(yǎng)基中，接種量為1% -3% (v/v)，25°C培養(yǎng)24小時，過氧化氨的除菌方式為膜過濾。
[0031] 步驟（4)中，菌種適應強氧化劑環(huán)境的指標為種子液干重達到25g/l，
[0032] 步驟巧）中，發(fā)酵方法為：將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，
[0033] 發(fā)酵培養(yǎng)基配比為：葡萄糖80~lOOg/L、酵母膏4~6g/l、1拆04 · 7肥0 3~ 5邑/1、化25046 ~9g/L、（畑4) 2S042 ~4g/l、KC1 0. 1 ~0. 5g/L、谷氨酸鋼 17 ~20g/l、 K肥P042~4g/L。接種量為10% (v/v)，培養(yǎng)條件為25°C~28°C，150巧m~170巧m。
[0034] 本發(fā)明的有益效果在于：
[00對 （1)本發(fā)明提供一種全新的馴化改造菌種的方法，目的性強，效率高。通過馴化得 到的菌株生長活力旺盛，耗糖耗氮速率加快，發(fā)酵周期短，產油率高，DHA含量比原始菌株提