人Tafazzin蛋白的生產(chǎn)工藝方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥工藝領(lǐng)域，具體涉及一種人Tafazzin蛋白的生產(chǎn)工藝方法
【背景技術(shù)】
[0002]心磷脂(card1lipin)是一種高度特異地分布在線粒體內(nèi)膜的磷脂，是線粒體保持形態(tài)完整、進(jìn)行氧化磷酸化和高效產(chǎn)生ATP的必需分子之一。已證實(shí)，在巴氏綜合征，糖尿病，心臟衰竭和帕金森病等疾病中線粒體形態(tài)改變和功能障礙往往伴隨病理性心磷脂缺失及心磷脂支鏈的改變。因此，研究參與心磷脂代謝的酰基轉(zhuǎn)移酶造成線粒體功能紊亂相關(guān)機(jī)制，將對疾病發(fā)展過程的認(rèn)識提供新的試驗(yàn)和理論依據(jù)，并為其治療提供可能的靶標(biāo)和效應(yīng)分子。
[0003]人類tafazzin基因位于X染色體(Xq28)。其編碼的tafazzin蛋白，是一組未知功能的蛋白，在心臟和骨骼肌中高表達(dá)。Tafazzin基因有12個外顯子，由不同的剪接產(chǎn)生129-292個氨基酸的蛋白。Vreken等人發(fā)現(xiàn)，人類成纖維細(xì)胞中的tafazzin突變后，心磷脂支鏈的成分亞油酸?；鶞p少。近期的研究證明，taffazin基因突變的酵母細(xì)胞，taffazin蛋白失活，導(dǎo)致心磷脂總含量降低和單溶心磷脂(monolysocard1lipin, MLCL)的積累，同時伴有心磷脂支鏈中不飽和脂肪酸?；湹膩G失。隨后，在人類、酵母和果蠅中，均發(fā)現(xiàn)由于tafazzin基因突變導(dǎo)致心磷脂分子種類嚴(yán)重紊亂。因此證實(shí)tafazzin參與了心磷脂重塑。在所有tafazzin突變的實(shí)例中，心磷脂的優(yōu)勢種類被眾多少數(shù)種類所取代，表明了?；D(zhuǎn)移的隨機(jī)性。這一結(jié)果進(jìn)一步支持了 tafazzin是維持心磷脂分子種類統(tǒng)一及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要重塑酶。在酵母細(xì)胞中，tafazzin主要將油酸?；ф?18:1)和棕櫚油酸酰基支鏈(16:1)轉(zhuǎn)移到心磷脂上。在tafazzin基因突變的酵母細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)氧化磷酸化偶聯(lián)缺陷，呼吸復(fù)合體移位，進(jìn)一步證實(shí)了異常的心磷脂重塑會引發(fā)線粒體功能障礙，證明了tafazzin對心磷脂代謝有重要作用。目前國內(nèi)外尚未對tafazzin蛋白與心磷脂代謝機(jī)制的關(guān)系進(jìn)行深入研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004](一)解決的技術(shù)問題
[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種人Tafazzin蛋白的生產(chǎn)工藝方法，本發(fā)明構(gòu)建tafazzin全長基因的原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)其重組蛋白表達(dá)，從而為tafazzin的純化、抗血清的制備及tafazzin蛋白與CL代謝機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，進(jìn)而為CL代謝異常疾病的治療提供理論依據(jù)。
[0006]( 二)技術(shù)方案
[0007]為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
[0008]—種人Tafazzin蛋白的生產(chǎn)工藝方法，包括以下步驟:
[0009]S1、Tafazzin基因的擴(kuò)增:以tafazzin全長基因的質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增tafazzin 基因；
[0010]S2、pEASY-El-tafazzin質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證:經(jīng)菌液PCR與基因測序結(jié)果鑒定，構(gòu)建pEASY-El-tafazzin原核表達(dá)載體；
[0011]S3、高表達(dá)宿主菌篩選:將鑒定正確的重組質(zhì)粒pEASY-El-tafazzin分別轉(zhuǎn)化BL21、BL21pLysS,、Transetta 三種表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞，SDS-PAGE 電泳表明 Transetta 菌株Tafazzin蛋白表達(dá)量相對最高，取其作為后期研究的重組菌，進(jìn)行大量培養(yǎng)，將帶有pEASY-El-tafazzin質(zhì)粒的菌液分成至少6份的1ml菌液，分別向其中加入終濃度為0?lmmol/L 的 IPTG ；
[0012]S4、將帶有 pEASY-El-tafazzin 質(zhì)粒的菌液，經(jīng) IPTG 35_37°C或 15_17°C誘導(dǎo)后收集菌液，分別取全菌蛋白樣品、上清可溶蛋白樣品和沉淀蛋白樣品，通過SDS-PAGE電泳對tafazzin蛋白小量誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行摸索并對其可溶性進(jìn)行分析；
[0013]S5、Tafazzin 蛋白 western blotting 鑒定。
[0014]優(yōu)選的，步驟S2所述的IPTG為誘導(dǎo)劑。
[0015]優(yōu)選的，步驟S2所述IPTG的加入終濃度分別為lmmol/L，0.5mmol/L，0.25mmol/L，
0.lmmol/L,0.05mmol/L，Ommol/L。
[0016]優(yōu)選的，步驟S4所述IPTG的溫度為37°C或16°C。
[0017](三)有益效果
[0018]本發(fā)明提供了一種人Tafazzin蛋白的生產(chǎn)工藝方法，本發(fā)明以tafazzin全長基因的質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了 876bp的產(chǎn)物，與目的片段大小一致，表明成功擴(kuò)增tafazzin基因。經(jīng)菌液PCR與基因測序結(jié)果鑒定，成功構(gòu)建pEASY-El-tafazzin原核表達(dá)載體。為篩選高效表達(dá)菌株，將鑒定正確的重組質(zhì)粒pEASY-El-tafazzin分別轉(zhuǎn)化BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS, Transetta (DE3)三種表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞，SDS-PAGE 電泳表明Transetta(DE3)菌株Tafazzin蛋白表達(dá)量相對最高，取其作為后期研究的重組菌，進(jìn)行大量培養(yǎng)。帶有pEASY-El-tafazzin質(zhì)粒的菌液，經(jīng)IPTG 37°C或16°C誘導(dǎo)后收集菌液，分別取全菌蛋白樣品、上清可溶蛋白樣品和沉淀蛋白樣品，通過SDS-PAGE電泳對tafazz in蛋白小量誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行摸索并對其可溶性進(jìn)行分析。表明在37°C ImM或0.05mM IPTG的誘導(dǎo)條件下，上清中有微量的目的蛋白，大部分蛋白為沉淀蛋白，表明目的蛋白以包涵體形式存在。在16°C ImM或0.05mM IPTG的誘導(dǎo)條件下，大部分表達(dá)蛋白為上清蛋白，雖表達(dá)量較低，但表明目的蛋白以可溶形式存在。我們通過Western Blot檢測對蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)。下一步本研究將純化重組蛋白pEASY-El-tafazzin以制備多克隆抗體，為探討CL代謝異常疾病的發(fā)病機(jī)制提供有效途徑。此外，還可以通過包涵體復(fù)性方式獲得有活性的心磷脂代謝的?；D(zhuǎn)移酶tafazzin,研究其酶學(xué)特性及催化活性，為進(jìn)一步研究tafazzin在CL代謝途徑中的功能奠定基礎(chǔ)?？梢姡晒?gòu)建pEASY-El-tafazzin原核表達(dá)載體及蛋白小量誘導(dǎo)表達(dá)條件的摸索并對其可溶性進(jìn)行了分析，為tafazzin的純化、抗血清的制備及生理功能檢測奠定了基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0019]為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0020]—種人Tafazzin蛋白的生產(chǎn)工藝方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0021]S1、引物設(shè)計(jì)
[0022]pEASY-El-Tafazzin (P1:5，_atgcctctgcacgtgaagtg_3，)
[0023]pEASY-El-Tafazzin (P2:5' -GTGGTGGTGGTGCTCGAGCCGGATC ATGTACGCCA-3，)用于PCR擴(kuò)增Tafazzin全長基因。
[0024]S2、Tafazzin 基因的擴(kuò)增
[0025]包含tafazzin全長基因的質(zhì)粒任敏東博士贈送，以此質(zhì)粒樣品為模板，P1和P2為引物，PCR擴(kuò)增tafazzin序列。反應(yīng)體系如下:質(zhì)粒樣品0.2 μ 1，5 X TransStart FastPfuFly Buffer 10 μ 1，PI 和 P2 各 2 μ 1(10 μmol/L)，dNTPs 4 μ 1 (2.5mmol/L), TransStartFastPfu Fly DNA Polymerase 1 μ 1，加滅菌超純水至 50 μ 1。PCR 反應(yīng)條件:95°C 2min ;95°C 10s, 55°C 20s，72°C 30s, 35 個循環(huán) 72°C，5min。PCR 產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了 876bp的產(chǎn)物，與目的片段大小一致，表明成功擴(kuò)增tafazzin基因，回收PCR產(chǎn)物。
[0026]S3、pEASY-E 1-tafazzin質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證
[0027]取tafazzin 基因的 PCR 回收產(chǎn)物 4 μ 1，pEASY-ElBlunt El Express1nVector1 μ 1，輕輕混合，室溫連接5min。連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化至50 μ 1 Trans 1-TlPhage Resistant感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于氨芐(Amp+)抗性的平板上，37°C過夜培養(yǎng)。
[0028]從平板上隨機(jī)挑取5個單菌落，分別將這些單菌落混勻在滅菌超純水10 μ 1中，取1 μ 1作為模板進(jìn)行菌液PCR鑒定，具體反應(yīng)條件與反應(yīng)體系如下:菌液1 μ 1，T7PromoterPrime;r (10 μ mol/L) 0.5 μ 1，Ρ2 引物0.5 μ 1，2 XEasyTaq PCR Sup