一種增強(qiáng)玉米外源基因表達(dá)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程，具體地說，設(shè)及一種增強(qiáng)玉米外源基因表達(dá)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究和應(yīng)用，既需要研究開發(fā)出高效、易操作和低成本的外源基因 遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，也要求使已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因受體生物染色體上的外源轉(zhuǎn)基因能夠高水平的 穩(wěn)定表達(dá)，W在受體生物上實(shí)習(xí)外源基因的功能，但是，外源轉(zhuǎn)基因進(jìn)入受體后常常發(fā)生表 達(dá)量降低，甚至轉(zhuǎn)基因沉默等現(xiàn)象，并沒有達(dá)到預(yù)期表達(dá)水平。據(jù)報(bào)道，外源基因插入受體 染色的位置效應(yīng)，轉(zhuǎn)錄中基因沉默和轉(zhuǎn)錄后的基因沉默等影響了外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中 表達(dá)效率（李宏，2004)。目前，提高外源基因表達(dá)主要采用選擇強(qiáng)的啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子；選擇強(qiáng)的終止子；使用增強(qiáng)子等方法；也可W選擇適宜的轉(zhuǎn)化方法；或者用葉綠體作為 轉(zhuǎn)化受體；篩選單拷貝后代植株；使用信號(hào)膚；使用病毒編碼蛋白；外源基因的修飾與改 造；消除DNA甲基化的影響；使用受體生物偏愛的密碼子；包括使用核質(zhì)結(jié)合區(qū)序列（MAR 序列）等（StiefAetal，1989)。而研究證實(shí)，將MR與外源基因作為共同單元，構(gòu)建表達(dá) 載體可W不受物種限制，并具有操作簡單效率高的特點(diǎn)，可W使外源基因在當(dāng)代穩(wěn)定表達(dá) 而且促進(jìn)外源基因在后代的穩(wěn)定遺傳（Migueletal，2007)，贏得重視。
[0003] MR序列是染色質(zhì)上的一段與核基質(zhì)結(jié)合的DM序列，分布間隔為5-200化，MR 的長度一般為300-1000bp，少數(shù)可達(dá)幾個(gè)肺。常含一些特征基序，如A-box(AATAAAYAAA)、 T-boxOTWTWTTWTT)、酵母自主復(fù)制序列ARS、拓?fù)洚悩?gòu)酶II識(shí)別位點(diǎn)和能形成蛋白質(zhì)識(shí) 別位點(diǎn)的松散DNA、彎曲DNA，富含AT區(qū)等。除了上述的一般特征外，不同的MRS還具有其 特殊的結(jié)構(gòu)序列或特征。一些基因兩側(cè)的MR有著不同的屬性，玉米a化I基因附近區(qū)域的 MAR與核基質(zhì)結(jié)合時(shí)能形成7-70化的染色質(zhì)環(huán)，在運(yùn)個(gè)染色質(zhì)區(qū)域a化I基因5'端的MAR 對核酸酶的酶解尤其敏感，而它對a化I基因的表達(dá)調(diào)控又是必需的。西紅柿hsc80基因的 5' -MAR與3' -MAR有著截然不同的結(jié)合屬性。β-菜豆蛋白基因5' -MAR與3' -MAR有著 截然不同的調(diào)節(jié)屬性（劉峰等，2003)。
[0004] MAR通過與核基質(zhì)結(jié)合使外源基因形成Loop環(huán)，而MAR處于Loop環(huán)的邊界處，每 一個(gè)Loop環(huán)形成一個(gè)拓?fù)渖溪?dú)立的區(qū)域，環(huán)的大小不影響其對外源基因的表達(dá)，染色體的 凝結(jié)與DNA的轉(zhuǎn)錄在此區(qū)域不受干擾的獨(dú)立進(jìn)行，從而造成一種分割作用，使每個(gè)轉(zhuǎn)錄單 元保持相對的獨(dú)立性，從而使環(huán)內(nèi)基因免受周圍染色質(zhì)的影響（XuMYetal，2010)。Loop 結(jié)構(gòu)模型暗示MR序列可能作為一個(gè)邊界元件阻止染色體的凝縮區(qū)域或外源基因附近的 調(diào)控元件對外源基因表達(dá)的影響，既可W使基因上游調(diào)控序列和基因啟動(dòng)子相互靠近，又 使環(huán)中的DNA序列靠近核基質(zhì)，便于基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子與RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子相互 作用，降低其受周圍染色質(zhì)狀態(tài)的影響，從而增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性，提高基因的轉(zhuǎn)錄水平，減 少基因沉默度roweretal，2002;Maximovaetal，2003)。 陽0化]根據(jù)MR序列在生物體內(nèi)功能的不同，可W簡單地把MR序列分為3類：第一類位 于基因的下游較遠(yuǎn)處，此類MR序列和核基質(zhì)的親和力比較高，在整個(gè)細(xì)胞周期中都保持 與核基質(zhì)的結(jié)合狀態(tài)，它們的作用是將染色質(zhì)分成許多大小不等的環(huán)，運(yùn)些DM環(huán)除了作 為染色質(zhì)高級(jí)組織結(jié)構(gòu)的基本成分，同時(shí)也是基因表達(dá)調(diào)控單位。第二類MR序列通常位 于基因的啟動(dòng)子區(qū)和上游調(diào)控序列的附近，與核基質(zhì)親和力較弱，只是在基因表達(dá)，啟動(dòng)轉(zhuǎn) 錄時(shí)才與核基質(zhì)暫時(shí)性地結(jié)合。第Ξ類MR和第二類MR相同之處是它也只和核基質(zhì)暫 時(shí)性地結(jié)合，不同之處是它們位于DNA復(fù)制起始區(qū)附近，和DNA復(fù)制起始點(diǎn)相鄰或在DNA復(fù) 制起始點(diǎn)中，在DNA復(fù)制時(shí)便于復(fù)制叉的形成度reyneet曰1，1994)。
[0006]MR和核基質(zhì)之間的相互作用具有進(jìn)化上的保守性，MR可W與異源的核基質(zhì)相 互作用燈etkoIVetal，2006)。張可偉等（2002)用水稻的核基質(zhì)來驗(yàn)證來自煙草和擬南 芥的MAR序列與核基質(zhì)的結(jié)合情況效果理想，李旭剛等（2001)的研究結(jié)果顯示來源于魏豆 的MR可W在煙草中提高外源基因的表達(dá)水平，表明不同生物種類的MR與核基質(zhì)是能夠 相互結(jié)合的，但并不是所有的MR都能夠與異源的核基質(zhì)相互作用，如人β-珠蛋白基因中 的MAR與煙草核基質(zhì)之間的結(jié)合能力就很弱。但已報(bào)到的結(jié)果中MAR序列都是從雙子葉植 物即煙草、擬南芥、大豆等中克隆，其次驗(yàn)證基因表達(dá)的是GUS報(bào)告基因，只是對功能基因 進(jìn)行驗(yàn)證，而見對外源功能基因表達(dá)效率驗(yàn)證的報(bào)道。因此通過GUS報(bào)告基因結(jié)果分析，可 W進(jìn)一步設(shè)想分析驗(yàn)證MR序列對外源抗蟲、抗除草劑基因在玉米等單子葉糧食作物中表 達(dá)的效率，W分析如何增強(qiáng)農(nóng)產(chǎn)品作物的抗性，為糧食生產(chǎn)做出突出貢獻(xiàn)。
[0007] 黃慧珍等人（2005)從煙草DNA中克隆到的M17基因的AT%含量大于70%，有明 顯的90%AT等結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步的序列分析表明，M17大小為674bp，AT%含量為71. 5%， 均含有MARs的部分特征基序如：A-box，T-box，拓?fù)洚悩?gòu)酶II識(shí)別位點(diǎn)，自主復(fù)制序 歹U(ARS，autonomouslyreplicatingsequences)，堿基非配對區(qū)（BUR，baseunpairing region),MAR識(shí)別序列（MRS,MARreco即itionsequence),復(fù)制起始點(diǎn)（ORI，originof replication),彎曲DNA序列kurvedDNAmotifs)等，M17 與原煙草MAR的特征motif及 其他序列特征并不相同，Blast分析認(rèn)為與GenBank中已登錄MARs無明顯相似性，因此認(rèn) 為是新的MR片段?，F(xiàn)已登錄GenBank，登錄號(hào)為AY766247。 陽00引 其中A-box=AATAAAYAA，5個(gè)；T-box=TTWTWTTWTT，7個(gè)；ARS= WTTTATRTTTW，2個(gè)；T0P0II=GTNWAYATTNA?NR，2個(gè)；BUR=AATATATTT，！個(gè)；MRS=TAWAWWWNNAWWRTAANNWWG，2個(gè)；0RI=ATTAorATTTAorATTTTA，23個(gè)；curved= AAAAN7AAAAN7AAAAorTTTAAA，3個(gè)；ATATTT，2個(gè)。
[0009] 黃慧珍等人已經(jīng)證實(shí)：在煙草中發(fā)現(xiàn)的新MR序列M17,單側(cè)連接M17的轉(zhuǎn)化植 株，其平均GUS活性提高2. 43倍，兩側(cè)順式重復(fù)連接M17的轉(zhuǎn)化植株中GUS活性可提高3. 14 倍。與單側(cè)連接的外源基因相比，兩端順式連接的外源基因與核基質(zhì)的結(jié)合更穩(wěn)定，可W富 集更多的調(diào)控因子促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，所形成的空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也更有利于環(huán)內(nèi)轉(zhuǎn)錄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 目前對于MR序列的研究，多數(shù)為將其轉(zhuǎn)入同源受體W提高目的基因表達(dá)量，而 對于轉(zhuǎn)入異源受體（尤其是玉米）的研究相對較少，如今玉米已經(jīng)成為我國第一大糧食作 物，隨著轉(zhuǎn)基因玉米的推廣，利用MR序列增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因玉米外源的表達(dá)尚未報(bào)道。本發(fā)明的 目的是利用從煙草基因組中克隆到已報(bào)道的MR片段M17，W玉米化II轉(zhuǎn)化受體為材料，通 過基因槍轟擊法將構(gòu)建好的含MR序列的載體轉(zhuǎn)入玉米受體材料胚性愈傷組織，探討MR 序列轉(zhuǎn)入異源受體（玉米）后對外源基因表達(dá)的調(diào)控作用。證實(shí)了MR序列增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因玉 米外源基因高效穩(wěn)定表達(dá)的作用，為進(jìn)一步開展玉米等糧食作物抗蟲、抗除草劑基因工程 奠定基礎(chǔ)。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種增強(qiáng)玉米外源基因表達(dá)的方法，所述 方法為將含MAR序列的載體轉(zhuǎn)入玉米受體材料胚性愈傷組織中，增強(qiáng)植物外源基因的高效 穩(wěn)定表達(dá)，減少基因沉默；所述MR序列為來自煙草的MR片段M17,核巧酸序列如SEQID No. 1所示。
[0012] 序列分析表明，它們具有90%AT-box，A-box，T-box，堿基非配對區(qū)域，拓?fù)洚悩?gòu) 酶II識(shí)別位點(diǎn)，彎曲DNA序列，復(fù)制起始序列和ATATTT等典型的MR序列特征。
[0013] 進(jìn)一步地，所述載體為重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)MR序列轉(zhuǎn)錄的 啟動(dòng)子為花挪菜花葉病毒（CAMV)35S啟動(dòng)子。
[0014] 進(jìn)一步地，所述載體為在PCAMBIA3301載體的多克隆位點(diǎn)處插入MR序列后得到。
[0015] 更進(jìn)一步地，所述多克隆位點(diǎn)為化〇1和Bs巧II。
[0016] 所述重組載體可為重組表達(dá)載體，也可為重組克隆載體。
[0017] 所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建。所述植物表達(dá)載體包括雙 元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如PCAMBIA3301、PCAMBIA1300、地1121、 PCAMBIA2301或其它衍生植物表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3'端非翻 譯區(qū)域，即包含聚腺巧酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺 巧酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺巧酸加入到mRNA前體的3'端。使用所述MAR片段構(gòu)建重組表達(dá)載體 時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核巧酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子， 例如花挪菜花葉病毒（CAMV)35S啟動(dòng)子、泛素基因化iquitin啟動(dòng)子（P化i)、脅迫誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子Rd29A等，它們可單獨(dú)使用或與其它的啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建 重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，運(yùn)些增強(qiáng)子區(qū)域可W是 ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，W保證整個(gè)序 列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可W是天然的，也可W是 合成的。翻譯起始區(qū)域可W來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或 植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用重組表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可 產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基 因等。但從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接W表型篩選轉(zhuǎn)化 植株。經(jīng)上述方法進(jìn)行篩選后還可采用Southern、PCR或點(diǎn)雜交等分子檢測手段對轉(zhuǎn)基因 植株進(jìn)行檢測，W確定其是否轉(zhuǎn)化有目的基因。
[0018] 植物表達(dá)載體可通過使用原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法（Ca2\PEG)、Ti質(zhì)粒、化質(zhì)粒、植 物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管導(dǎo)入、微注射、電激、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué) 方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、組織或器官，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組 織或器官培育成植株；所述組織和器官可包括宿主植物的果芙、愈傷組織、莖尖、葉片和種 子等。
[0019] 本發(fā)明還提供了MR序列在增強(qiáng)植物外源基因的高效穩(wěn)定表達(dá)，減少基因沉默方 面的應(yīng)用，其特征在于，所述MR序列為來自煙草的MR片段M17,核巧酸序列如SEQID No. 1所示。
[0020] 作為優(yōu)選，所述植物為