一種利用L-谷氨酸氧化酶催化生產α-酮戊二酸的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其涉及一種利用L-谷氨酸氧化酶催化生產α -酮戊二酸的方法。
【背景技術】
[0002]α -酮戊二酸(a -ketoglutarate，a -KG)是一種重要的生物化合物。作為三羧酸循環(huán)的重要中間代謝產物之一，α-酮戊二酸參與氨基酸、糖類、蛋白質以及脂肪代謝等重要生理過程，并且在微生物的碳氮代謝調控中起著重要作用。由于α-酮戊二酸在細胞代謝上的重要性，其被廣泛用于食品、醫(yī)藥、精細化工和化妝品行業(yè)，市場需求量巨大。特別地，L-精氨酸-α -酮戊二酸(1:1)和L-精氨酸-α -酮戊二酸(2:1)是目前國際市場上銷量日益增加的一種氨基酸鹽類保健品，作為功能性營養(yǎng)強化劑和護肝藥物，主要用于增強體格、促進肌肉的快速增長和恢復、促進肝細胞對營養(yǎng)和能量的吸收、維護肝功能正常等(中國發(fā)明專利申請公開號CN104109698A、CN101591271)。
[0003]目前，α-酮戊二酸的生產制備方法主要有化學合成法、微生物發(fā)酵法和酶催化轉化法。其中化學合成所使用的大量氰化物、重金屬離子、強酸強堿等有害試劑，嚴重限制該方法在醫(yī)藥、化妝品和食品等行業(yè)的應用。微生物發(fā)酵法制備α-酮戊二酸，具有生產條件溫和、工藝步驟簡單、對環(huán)境友好等優(yōu)點。但是其存在生產周期長、產品與發(fā)酵產物中多種成分混合在一起，導致提取與精制工藝復雜等缺點，總成本偏高，不適合工業(yè)化生產(中國發(fā)明專利申請公開號CN101717735A、CN102391977A)。酶催化轉化法具有催化反應條件溫和、轉化率高、轉化時間短、反應形成的副產物少，產物易分離等優(yōu)點，非常適合α -酮戊二酸的工業(yè)化生產(中國發(fā)明專利申請公開號CN102994467A、CN104109698A、)。
[0004]L-谷氨酸氧化酶(LGOX) [EC1.4.3.11]可以催化L-谷氨酸氧化脫胺生成α -酮戊二酉愛，氨和過氧化氫(Arima J, Tamura T, et al.The Journal of B1chemistry,2003, 134，805-812)。利用大腸桿菌表達系統生產的重組L_谷氨酸氧化酶是胞內酶，它的分離純化需要經過細胞裂解、親和層析等處理步驟(Niu P, Dong X，et al.Journal ofB1technology, 2014，179:56-62)。其中的親和層析雖然具有高選擇性、高活性回收率和高純度等特點，并已成為目前純化蛋白質等生物大分子最有效的技術之一，但它的缺點也很明顯，主要包括耗時大、成本高、處理量小等，這些缺陷不但使得這種純化蛋白質的生產工藝成本較高，而且也限制了其大規(guī)模的工業(yè)化應用。
[0005]類彈性蛋白多肽(elastin like polypeptides, ELP)是根據彈性蛋白相關序列人工合成的生物大分子，由五肽重復序列VPGXG (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，其中Xaa是除Pro以外的任意一種氨基酸)。ELP具有溫度敏感的可逆相變特性，在低于相變溫度細胞中呈溶解狀態(tài)，在高于相變溫度溶液中呈凝聚狀態(tài)，因此可以用簡單的離心法與細胞自身的雜蛋白進行有效分離。ELP融合蛋白仍能保持ELP的可逆相變特性，因此ELP可以作為分離重組蛋白一種很好的工具，并且該分離過程相比親和純化，具有簡單、價格低廉、易操作等優(yōu)點，具有工業(yè)化應用的前景(中國發(fā)明專利申請公開號CN10955960A、CN104725515A)。
[0006]L-谷氨酸氧化酶在大腸桿菌中表達后僅能得到谷氨酸氧化酶的前體，需要通過特殊處理后才能得到成熟的蛋白(Arima J, Tamura T, et al.The Journal ofB1chemistry, 2003, 134, 805-812)。據報道，通過使用金屬內肽酶(Arima J, Tamura T,et al.The Journal of B1chemistry, 2003, 134, 805-812)和 Factor X 蛋白酶(中國發(fā)明專利公開申請?zhí)朇N104726472A)的酶切，可獲得成熟的L-谷氨酸氧化酶。本發(fā)明利用蛋白酶K代替金屬內肽酶和Factor X蛋白酶，發(fā)現酶切獲得的L-谷氨酸氧化酶具有與報道的經金屬內肽酶酶切的L-谷氨酸氧化酶同樣的酶學特性。因此，本發(fā)明將ELP的溫度敏感特性與L-谷氨酸氧化酶的酶切特性相結合，將重組大腸桿菌表達的LG0X-ELP融合蛋白用于重組L-谷氨酸氧化酶的快速分離純化，從而可滿足α -酮戊二酸的規(guī)?；a。

【發(fā)明內容】

[0007]
為了解決上述的技術問題，本發(fā)明的目的是提供一種利用L-谷氨酸氧化酶催化生產α -酮戊二酸的方法，采用本發(fā)明可進一步降低L-谷氨酸氧化酶的生產成本和使用成本，實現大規(guī)模的分離純化L-谷氨酸氧化酶，以滿足α -酮戊二酸的規(guī)?；a。
[0008]為了實現上述的目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案:
(1) L-谷氨酸氧化酶基因的合成:根據Streptomyces sp.X_119_6的L-谷氨酸氧化酶的原始基因序列，按照大腸桿菌密碼子分析用表對原始基因序列進行密碼子優(yōu)化，并進行L-谷氨酸氧化酶基因的全合成，合成后的全基因兩端分別帶用Afcol和及01酶切位點并連接到原核表達載體pET28a (+)上，獲得融合表達載體pET28a-LG0X。優(yōu)化的L-谷氨酸氧化酶基因序列如SEQ N0.1所示。
[0009](2)融合表達載體pET-LGOX-ELP的構建:根據L-谷氨酸氧化酶基因序列，設計一對引物，上游引物:5 ’ -CATGCCATGGGCACGACCGATACTGC
AAGAAGGC-3 '下游引物:5 ’ -CCCTCGAGCTAGAATTCCATATGTGAGGTCAAGGCTTCCTCACGCATTG-3 ’，其中上游引物含有Afcol酶切位點，下游引物含有ZAol、EcoRi和Nde\酶切位點。以pET28a-LG0X為模板，通過PCR獲得的目的片段，割膠純化后經Afcol和ΖΑοΙ雙酶切后與同樣經過雙酶切的載體pET28a進行連接，獲得載體pET_LG0X。用Ndel和EcoRi對載體pET_EICM_MBP進行雙酶切，獲得ELP基因片段并與同樣經過雙酶切的載體pET-LGOX進行連接，獲得融合表達載體pET-LGOX-ELP。
[0010](3)將融合表達載體轉化到大腸桿菌中:將融合表達載體pET-LGOX-ELP通過熱激轉化法轉到表達菌株Rosetta (DE3)中，然后涂布到含有卡那霉素(Kana)和氯霉素(Chi)的瓊脂平板上進行抗性篩選，37°C培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，小量擴增后提取質粒，然后進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察，含有質粒條帶的為實驗所需的重組大腸桿菌。
[0011](4)LG0X-ELP融合蛋白的表達:將5 μ L甘油菌加入到5 mL含卡那霉素(Kana)和氯霉素(Chi)的LB培養(yǎng)液(1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉，pH 7.0)中，37°C，200轉/分，搖床培養(yǎng)過夜，次日取1 mL菌液加入到含卡那霉素(Kana)和氯霉素(Chi)的100 mLLB培養(yǎng)基中，37°C下振蕩培養(yǎng)至細胞生長密度0D_=0.6-0.8，然后添加異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.1 mM，25_28°C下誘導培養(yǎng)8_16 h。
[0012](5)細胞破碎:5000 g 離心 10 min 后收集菌體，用 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液洗滌菌體三次，然后再用0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液重懸，超聲破碎后13000 g，4°C離心10 min，取上清，即為粗酶液。
[0013](6)融合蛋白的純化:在粗酶液中添加硫酸銨至終濃度為0.4 M，37°C水浴10 min使得融合蛋白發(fā)生凝聚，13000 g室溫離心10 min后，棄上清。用預冷的0.1 M Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液重懸沉淀部分，使其重新溶解在緩沖液中。反復幾次獲得純的融合蛋白LG0X-ELP。
[0014](7)融合蛋白的酶切:用蛋白酶K對融合蛋白進行4°C過夜酶切，酶切后置于70°C水浴中使得蛋白酶K變性，13000 g，4°C離心10 min后去除變性的蛋白酶K，獲得成熟的
L-谷氨酸氧化酶。
[0015](8)酶切前后熱穩(wěn)定性的比較:將LG0X-ELP融合蛋白和成熟的L-谷氨酸氧化酶分別至于一系列不同溫度下保溫1 h，然后測定所殘余酶活。
[0016](9)利用酶切后的L-谷氨酸氧化酶催化生產α -酮戊二酸:在3 L發(fā)酵罐中配置含有120 g/L L-谷氨酸的磷酸緩沖液，添加15 U/mL的L-谷氨酸氧化酶和200 U/mL過氧化氫酶后在30 °C，220 rpm下進行轉化反應。
[0017]與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:采用本發(fā)明可進一步降低L-谷氨酸氧化酶的生產成本和使用成本，實現大規(guī)模的分離純化L-谷氨酸氧化酶，以滿足α -酮戊二酸的規(guī)?；a。
【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明L-谷氨酸氧化酶的純化重組過程圖。
[0019]圖2是本發(fā)明構建的重組L-谷氨酸氧化酶的表達質粒pET28-LG0X的過程圖。
[0020]圖3是本發(fā)明構建的重組L-谷氨酸氧化酶的表達質粒pET-LGOX-ELP的過程圖。
[0021]圖4 是大腸桿菌 Rosetta (DE3)、Rosetta (DE3)/pET28_LG0X、Rosetta (DE3) /PET28-ELP 和 Rosetta (DE3) /pET-LGOX-ELP 誘導表達后目標蛋白的 SDS-PAGE 電泳圖。
[0022]圖5是融合蛋白經一輪ITC純化后的SDS-PAGE電泳圖。
[0023]圖6是融合蛋白經酶切前后對熱穩(wěn)定性的圖。
[0024]圖7是成熟的L-谷氨酸氧化酶催化谷氨酸生產α -酮戊二酸的曲線圖。
[0025]圖8是融合蛋白的親和純化表。
圖中說明:
圖4、圖5中:Μ表示目標蛋白，1表示大腸桿菌Rosetta (DE3)，2表示Rosetta (DE3) /pET28_LG0X，3 表不 Rosetta (DE3) /pET28_ELP，4 表不 Rosetta (DE3) /pET-LGOX-ELP。
【具體實施方式】
[0026]下面結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】做一個詳細的說明。
[0027]如圖1?圖8所示的一種利用L-谷氨酸氧化酶