針對(duì)食品中的沙門(mén)氏菌和志賀氏菌的多重pcr檢測(cè)用引物組、試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品微生物安全檢測(cè)領(lǐng)域，涉及利用多重PCR技術(shù)對(duì)食品中的致病菌 進(jìn)行快速檢測(cè)鑒定的引物組、試劑盒及方法。具體而言，本發(fā)明涉及針對(duì)食品中的沙口氏菌 (Salmonellasp.)和志賀氏菌（Shigellasp.)的多重PCR檢測(cè)用引物組、試劑盒及檢測(cè)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近幾年，食品安全事件頻頻出現(xiàn)，食品安全問(wèn)題也越來(lái)越被社會(huì)公眾所關(guān)注和重 視。許多食源性致病菌通過(guò)水和食物傳播而引發(fā)食源性疾病，其發(fā)病率和死亡率都呈現(xiàn)逐 漸增加的趨勢(shì)。在世界范圍內(nèi)，每年有超過(guò)30 %的人口感染食源性疾病，造成數(shù)十億美元的 花銷(xiāo)。預(yù)防和控制食源性疾病的發(fā)生和傳播，已成為解決社會(huì)食品安全問(wèn)題的重要舉措之 一。能否及時(shí)有效地控制與預(yù)防食源性疾病的發(fā)生和傳播，關(guān)鍵在于能否快速準(zhǔn)確地檢測(cè) 與鑒定食源性致病菌。
[0003] 沙口氏菌和志賀氏菌是引起食源性疾病主要的兩類(lèi)致病菌，國(guó)內(nèi)外由送兩類(lèi)致病 菌引發(fā)的食物中毒事件頻頻發(fā)生。送兩類(lèi)致病菌在食品中分布比較普遍，其污染食品后，不 僅導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)，還能產(chǎn)生多種毒素，造成嚴(yán)重的疾病，如沙口氏菌會(huì)引起局部化賊感 染、肺炎、偽膜性腸炎、必包炎、敗血癥、賊毒癥等；志賀氏菌會(huì)引起腸炎、腸潰瘍、腸功能奈 吉U中毒性休克等。
[0004] 目前世界各國(guó)都把沙口氏菌和志賀氏菌列為食品衛(wèi)生的法定檢測(cè)項(xiàng)目。在檢測(cè)手 段上，目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)機(jī)構(gòu)仍主要采用FDA、A0AC、ISO和GB等標(biāo)準(zhǔn)對(duì)沙口氏菌和志賀氏菌 進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)過(guò)程一般需要3-5天，上述檢測(cè)手段操作復(fù)雜，檢測(cè)通量不高，很難滿足對(duì) 食源性致病菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確檢測(cè)的現(xiàn)實(shí)需求。因此，建立新的對(duì)沙口氏菌和志賀氏菌進(jìn)行 快速檢測(cè)的方法就顯得尤為迫切。
[0005] 近年來(lái)，借助于免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方法，對(duì)沙口氏菌和志賀氏菌的快速檢 測(cè)有了很大發(fā)展，目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)沙口氏菌和志賀氏菌進(jìn)行快速檢測(cè)的方法很多，如； PCR-凝膠電泳法、實(shí)時(shí)英光PCR法、基因芯片測(cè)試法、全自動(dòng)細(xì)菌生化檢定儀、酶聯(lián)免疫吸 附法、英光免疫檢測(cè)法（VIDA巧、膠體金免疫測(cè)試條等。但是，免疫學(xué)方法如酶聯(lián)免疫吸附 法、免疫英光法和乳膠凝集試驗(yàn)等在操作程序、檢測(cè)時(shí)間和特異性等方面尚不理想，并且檢 測(cè)成本極高；而在分子生物學(xué)方法方面，如PCR技術(shù)則W靈敏、特異、簡(jiǎn)便、快速、成本低等 優(yōu)點(diǎn)被越來(lái)越多地應(yīng)用。
[0006] W單目標(biāo)基因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象的常規(guī)單重PCR技術(shù)假陽(yáng)性高、通量低、無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)多 個(gè)目標(biāo)基因及多種目的菌的同時(shí)檢測(cè)，相比之下，多重PCR技術(shù)能在同一PCR反應(yīng)體系內(nèi) 實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因的同步擴(kuò)增，從而能夠快速、靈敏、特異地檢測(cè)食源性致病菌。具體而 言，多重PCR檢測(cè)法采用將多個(gè)目標(biāo)基因聯(lián)用的方式，只要檢測(cè)出多個(gè)目標(biāo)基因中的任意 一種，即可做出初步判斷；進(jìn)而，通過(guò)不同目標(biāo)基因間檢測(cè)結(jié)果的互相映證，便可實(shí)現(xiàn)提高 檢測(cè)準(zhǔn)確度、降低假陽(yáng)性率的效果。
[0007]目前，應(yīng)用多重PCR對(duì)食品中的常見(jiàn)致病菌進(jìn)行檢測(cè)已有較多報(bào)道，但由于多種 因素，例如所選取的引物和模板的種類(lèi)和濃度、Mg2+和dNTP的濃度等均可能對(duì)多重PCR的 結(jié)果產(chǎn)生影響，因此，同時(shí)檢測(cè)的目標(biāo)微生物種類(lèi)越多，建立PCR體系的難度越大，檢測(cè)的 特異性及靈敏度越難得到保證。
[000引在影響針對(duì)多菌種的多重PCR檢測(cè)的諸多因素中，目標(biāo)基因的數(shù)目和種類(lèi)的選取 至關(guān)重要。若目標(biāo)基因的數(shù)目過(guò)多，PCR體系中加入的引物對(duì)數(shù)量過(guò)多，產(chǎn)生非預(yù)期反應(yīng)的 概率增大，導(dǎo)致電泳鑒定圖中出現(xiàn)雜帶或造成拖尾等，從而影響檢測(cè)效率；而若將引物加入 不同的PCR體系分別進(jìn)行反應(yīng)，勢(shì)必又會(huì)降低通量。另外，目標(biāo)基因種類(lèi)的選取對(duì)于是否能 夠有效進(jìn)行多重PCR檢測(cè)而言也是關(guān)鍵因素之一：如果目標(biāo)基因特異性過(guò)高（即種屬分布 過(guò)窄），例如像大多數(shù)現(xiàn)有方法中所側(cè)重的主要用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)目的的毒素基因等，會(huì)造成檢 測(cè)覆蓋種類(lèi)不足，從而造成漏檢等問(wèn)題；反之，則可能會(huì)引起假陽(yáng)性率高等弊端。因此，對(duì)目 標(biāo)基因數(shù)目和種類(lèi)的選擇仍亟待優(yōu)化，具體而言，如何選擇對(duì)于沙口氏菌和志賀氏菌的全 部菌株而言均具有高覆蓋度和高特異性的目標(biāo)基因，仍是多重PCR檢測(cè)中的難題。
[0009] 進(jìn)而，在目標(biāo)基因選定后，針對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行的引物設(shè)計(jì)同樣可能從根本上 影響多重PCR檢測(cè)的結(jié)果；由于需要在同一PCR體系中針對(duì)不同目標(biāo)基因進(jìn)行同步擴(kuò)增，適 宜各引物對(duì)的反應(yīng)條件需能夠彼此配合、且各引物對(duì)之間不會(huì)相互干擾，從而確保針對(duì)各 目標(biāo)基因的PCR反應(yīng)均能夠順利、準(zhǔn)確地進(jìn)行。
[0010] 此外，考慮到食品中僅含有少量沙口氏菌或志賀氏菌即會(huì)引發(fā)食源性疾病，對(duì)檢 測(cè)方法的靈敏度也存在較高要求?，F(xiàn)有的PCR技術(shù)W沙口氏菌或志賀氏菌的基因組DNA為 模板時(shí)的檢測(cè)靈敏度通常在10~l(K)pg/μL左右，且尚未有關(guān)于同時(shí)W如上兩種菌的基因 組DNA為模板的多重PCR檢測(cè)的靈敏度的報(bào)道?？梢?jiàn)，現(xiàn)有技術(shù)并不能完全滿足食品安全 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的需求。因此，仍需開(kāi)發(fā)靈敏度更高的PCR檢測(cè)法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 針對(duì)W上不足，本發(fā)明組合利用了沙口氏菌和志賀氏菌的種屬特異性鑒別基因， 采用多重PCR技術(shù)對(duì)沙口氏菌和志賀氏菌同時(shí)進(jìn)行快速檢測(cè)。在比對(duì)分析沙口氏菌和志賀 氏菌的種屬特異性鑒別基因的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)篩選出針對(duì)兩種細(xì)菌的種屬特異性引物對(duì)及引 物組，優(yōu)化組合建立了多重PCR檢測(cè)體系，并開(kāi)發(fā)了沙口氏菌和志賀氏菌多重PCR檢測(cè)用試 劑盒；同時(shí)，結(jié)合樣品前增菌和前處理技術(shù)，建立了檢測(cè)覆蓋范圍廣、特異性強(qiáng)且靈敏度高 的檢測(cè)方法，由此完成了本發(fā)明。
[0012] 在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于快速檢測(cè)食品中的沙口氏菌和志賀氏菌的多 重PCR檢測(cè)用引物組，所述引物組包括如下引物對(duì)：
[0013] 沙口氏菌檢測(cè)用引物對(duì)：
[0014] 侵襲蛋白A基因（invA基因）擴(kuò)增用引物對(duì)：
[0015] invA-F;TTGACGAGCTTTATCATTGTCTG(沈QIDNO. 1);
[0016] invA-R：ACGTCTTTTTCTCTTGGTGCC(SEQIDNO. 2),
[0017] 和 / 或
[001引侵襲基因正調(diào)節(jié)蛋白A基因化ilA基因）擴(kuò)增用引物對(duì)：
[0019]hilA-F：TGAATTACGCTCACAACACCTG(SEQIDNO. 3)；
[0020] hilA-R：TGCTAAGCAACCAGATTACGATG(SEQIDNO. 4),
[0021] W及志賀氏菌檢測(cè)用引物對(duì)：
[00過(guò)侵染性質(zhì)?？乖Щ颍╥p址基因）擴(kuò)增用引物對(duì)：
[0023]ipaH-F：CTCACATGGAACAATCTCCG(SEQIDNO. 5)；
[0024]ipaH-R：TCATTCTCTTCACGGCTTCTG(SEQIDNO.6),
[002引和/或
[0026] 侵染性質(zhì)?？乖瑽基因（ipaB基因）擴(kuò)增用引物對(duì)：
[0027]ipaB-F;TGAAAGCAGTCATTGAACCC(沈QIDNO. 7);
[0028]ipaB-R;TGAGAGTTGGACATTGAGGC(沈QIDNO.8)。
[0029] 在第二方面，本發(fā)明提供了一種用于快速檢測(cè)食品中的沙口氏菌和志賀氏菌的多 重PCR檢測(cè)用試劑盒，所述試劑盒中包含本發(fā)明的多重PCR檢測(cè)用引物組，所述引物組包括 如下引物對(duì)：
[0030] 沙口氏菌檢測(cè)用引物對(duì)：
[0031] 侵襲蛋白A基因（invA基因）擴(kuò)增用引物對(duì)：
[0032]invA-F;TTGACGAGCTTTATCATTGTCTG(沈QIDNO. 1);
[0033]invA-R：ACGTCTTTTTCTCTTGGTGCC(SEQIDNO. 2),
[0034]和 / 或
[0035] 侵襲基因正調(diào)節(jié)蛋白A基因化ilA基因）擴(kuò)增用引物對(duì)：
[0036]hilA-F：TGAATTACGCTCACAACACCTG(SEQIDNO. 3)；
[0037]hilA-R：TGCTAAGCAACCAGATTACGATG(SEQIDNO. 4),
[0038]W及志賀氏菌檢測(cè)用引物對(duì)：
[0039] 侵染性質(zhì)?？乖Щ颍╥p址基因）擴(kuò)增用引物對(duì)：
[0040]ipaH-F：CTCACATGGAACAATCTCCG(SEQIDNO. 5)；
[0041]ipaH-R：TCATTCTCTTCACGGCTTCTG(SEQIDNO.6),
[0042]和 / 或
[0043] 侵染性質(zhì)?？乖瑽基因（ipaB基因）擴(kuò)增用引物對(duì)：
[0044]ipaB-F;TGAAAGCAGTCATTGAACCC(沈QIDNO. 7);
[0045]ipaB-R;TGAGAGTTGGACATTGAGGC(沈QIDNO.8)。
[0046] 在第H方面，本發(fā)明還提供了一種使用本發(fā)明的多重PCR檢測(cè)用引物組或試劑盒 對(duì)食品中的沙口氏菌和志賀氏菌進(jìn)行快速檢測(cè)的方法，所述方法包括W下步驟：
[0047]a)從所述食品中獲取模板DNA的前處理步驟；
[0048]b)使用本發(fā)明的多重PCR檢測(cè)用引物組或試劑盒對(duì)所述模板DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò) 增的步驟；
[0049]C)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的步驟，
[0050] 從而對(duì)所述食品中沙口氏菌和志賀氏菌的存在及含量進(jìn)行分析。
[005。本發(fā)明所建立的針對(duì)食品中的沙口氏菌和志賀氏菌的多重PCR檢測(cè)用引物組和 試劑盒及檢測(cè)方法通過(guò)組合使用沙口氏菌的種屬特異性鑒別基因invA和hi1AW及志賀氏 菌的種屬特異性鑒別基因ipaB和ip址作為目標(biāo)基因，具有檢測(cè)適用面廣、對(duì)沙口氏菌和志 賀氏菌種屬覆蓋全面、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，從而有效解決了文獻(xiàn)中報(bào)道的針對(duì)沙口 氏菌和志賀氏菌的多重PCR檢測(cè)方法中由檢測(cè)覆蓋種類(lèi)不足、引物特異性差及靈敏度不強(qiáng) 等因素造成的漏檢、假陽(yáng)性等問(wèn)題。此外，本發(fā)明提供的針對(duì)食品中的沙口氏菌和志賀氏菌 的多重PCR檢測(cè)方法還具備檢測(cè)耗時(shí)短、操作較簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低等特點(diǎn)，可大大節(jié)省檢測(cè) 成本和時(shí)間，提高檢測(cè)的通量及準(zhǔn)確性，具有廣泛的推廣應(yīng)用市場(chǎng)前景。
【具體實(shí)施方式】
[0052] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，除本發(fā)明的多重PCR檢測(cè)用引物組外，本發(fā)明的多 重PCR檢測(cè)用試劑盒中可進(jìn)一步包含反應(yīng)緩沖液、4種脫氧核巧Η磯酸、DNA聚合酶等成分。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明一些優(yōu)選的實(shí)施方式，除本發(fā)明的多重PCR檢測(cè)用引物組外，本發(fā)明 的多重PCR檢測(cè)用試劑盒中可進(jìn)一步包含具有如下成分的PCR反應(yīng)基礎(chǔ)溶液；Tris-肥1 ; KC1 ;MgCl2;dATP、dTTP、dGTP及dCTP;W及TaqDNA聚合酶。
[0054] 根據(jù)本發(fā)明一些更為優(yōu)選的實(shí)施方式，在本發(fā)明的多重PCR檢測(cè)用試劑盒中，各 成分W如下濃度包含于25μL的PCR最終反應(yīng)溶液中：
[00巧] Tris-HCllOrnM； 獻(xiàn)I 50mM； Μ裝Ch :!.0~3.0mM: dATP、dTTP、dGTP沒(méi)dCTJP 各 0J. -、03mM; Tiu]DN.A聚含黯 2.5U;
[0056] invA基因擴(kuò)增用引物對(duì)和/或hilA基因擴(kuò)增用引物對(duì)