一種直接對miRNA進(jìn)行絕對定量檢測的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種血漿miRNA定量檢測的方法，尤其設(shè)及一種直接對血漿miR-122 進(jìn)行絕對定量檢測的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 成熟miRNA是一類由22個(gè)堿基（nt)組成的、具有調(diào)控基因表達(dá)作用的單鏈小分 子核糖核酸，鑲嵌于4種Argonaute(Ago)之一的蛋白質(zhì)中，形成RNA介導(dǎo)的基因沉默復(fù)合 體巧ISC)。RISC在mRNA上滑動，當(dāng)在mRNA的3'端非翻譯區(qū)（3' -UTR)區(qū)域遇上與miRNA 互補(bǔ)的祀序列時(shí)，就會抑制利用該mRNA進(jìn)行的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。miRNA是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的唯一一類 通過與被調(diào)控的祀基因3'-UTR堿基序列配對而發(fā)揮調(diào)控作用的調(diào)控因子，使miRNA與被調(diào) 控的祀基因之間建立起獨(dú)特的1對1或1對多的特異性，影響并參與維持細(xì)胞的生理狀態(tài) 和分化程度。通過對細(xì)胞的影響，特定miRNA表達(dá)量的變化影響并維持組織的特征，反映生 物個(gè)體的生理病理特征，預(yù)示其作為鑒定多種疾病的生物標(biāo)記的可能性。例如脊椎動物都 擁有的、進(jìn)化保守的miR-122,只在肝細(xì)胞中富集，每個(gè)肝細(xì)胞中所含拷貝數(shù)可達(dá)5萬之多。 不論何種原因?qū)е赂渭?xì)胞的損壞時(shí)，miR-122被釋放，經(jīng)血液帶至全身，血液中的miR-122 水平變化就可W掲示肝臟受損的情形。血液中富含RNA降解酶，因此游離RNA分子在血液 中的存活期僅為幾分鐘，而成熟miRNA分子受蛋白質(zhì)復(fù)合體的保護(hù)而不被降解。事實(shí)上，室 溫下放置24小時(shí)或10次W內(nèi)反復(fù)凍融處理對血清miRNA濃度沒有影響。血液，也包括其 它體液，如腦脊液、尿液、淚液等含有的miRNA,都具有運(yùn)樣的特質(zhì)，使其成為最具潛力的無 創(chuàng)診斷生物標(biāo)記物。
[0003] 大量的文獻(xiàn)報(bào)道，都證實(shí)血清miR-122水平升高可W專一地掲示肝細(xì)胞的實(shí)時(shí)損 傷。肝細(xì)胞含有多達(dá)5萬個(gè)miR-122度issels，2009)，肝臟一旦受到損害，受損肝細(xì)胞的 miRNA釋放到血液，引起血液miRNA水平的改變。健康人血液中miR-122的含量維持在每微 升300個(gè)拷貝數(shù)左右。W成人4升血液計(jì)算，約100個(gè)肝細(xì)胞受損釋放進(jìn)入血液的miR-122 可W使每微升血液miR-122的水平升高1. 25個(gè)拷貝數(shù)，對應(yīng)每微升血漿為2. 5個(gè)拷貝。 miRNA在血液中的半衰期小于24小時(shí)，因此血液中miR-122拷貝數(shù)的改變可W實(shí)時(shí)而專一 地反映肝損害的程度。因此血液miR-122絕對分子數(shù)目的定量測定對于肝細(xì)胞損傷程度的 實(shí)時(shí)研判具有特殊的意義，目前尚缺乏健康人血清miR-122濃度的基礎(chǔ)值數(shù)據(jù)，和具有實(shí) 用價(jià)值的miRNA客觀測定方法。
[0004] 目前應(yīng)用的miRNA定量測定技術(shù)主要有：逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)、RNA-seq 深度測序法、microArray雜交測定法、NanoStringnCounter及納米微孔測序法。運(yùn)些測定 方法有一些共同點(diǎn)，如：需要純化的RNA、靈敏度低、內(nèi)源性標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)校準(zhǔn)等，測定結(jié)果為 miRNA含量相對倍數(shù)，而非拷貝數(shù)。除了RT-qPCR法，其余方法均有測定靈敏度低的缺陷， 如其中最靈敏的NanoStringnCounter法的測定低限為lamol或6xl0~5個(gè)分子W上的水 平，而miR-seq和microArray的測定低限更高，0.Ifmol分子W上，不滿足臨床診斷的需要。 循環(huán)miRNA表達(dá)量的巨大變動，加上miRNA擁有超短的長度、相似的序列、二級構(gòu)象、末端修 飾、含有相同序列的前體及長度差異性等特性，給目前miRNA定量測定技術(shù)的客觀性帶來 很大的挑戰(zhàn)。
[0005]RT-qPCR等測定方法需要測定樣本中至少一個(gè)內(nèi)源性標(biāo)準(zhǔn)RNA分子作為衡量目標(biāo) 分子定量的基準(zhǔn)值。運(yùn)個(gè)（些）內(nèi)源性標(biāo)準(zhǔn)RNA分子必須是在樣本中恒量表達(dá)的。迄今為 止，還沒有發(fā)現(xiàn)理想的內(nèi)源性標(biāo)準(zhǔn)RNA分子。有的測定方法，如NanoStringnCounter利用 表達(dá)豐度最高的前100個(gè)miRNA的平均值作為參照值，雖然在一些測定中運(yùn)些校正方法可 能有幫助，但沒有從根本上擺脫對內(nèi)源性標(biāo)準(zhǔn)RNA分子的依賴，得到的定量結(jié)果仍然是相 對的。RNA極易被RNases降解，測定結(jié)果受樣本采集方式、保存、純化方法的影響導(dǎo)致不同 的結(jié)論。運(yùn)是影響利用RNA作分子診斷的最大障礙，為了克服運(yùn)個(gè)障礙有賴于發(fā)現(xiàn)與所研 究對象無關(guān)的'看家基因'作對照。Beta-actin、GAPDH、U6、RNU24等基因?yàn)槌Ｓ玫膶φ栈?因，miR-16、miR-10b、miR-30a、miR-24等為常用的血清miRNA參照物，認(rèn)為其表達(dá)水平是相 對恒定不變的，但愈來愈多的研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)些常用的看家基因的表達(dá)與疾病或病理狀態(tài)是相 關(guān)的，不是理想的參照物。
[0006] 測定技術(shù)的靈敏度決定了運(yùn)些方法對RNA純化富集的依賴，不可能直接測定血清 樣本中的miRNA的含量。例如，血清經(jīng)加熱處理后，可通過microArray雜交法可W直接測 量其中高度富集的miRNA的含量，因方法定量底限為1〇6拷貝W上，沒有被廣泛的采納。
[0007] 健康人血清中可W測到miR-122的存在，但含量極低，肝損傷患者血清miR-122 濃度有上百倍的提升，因此對測定方法的靈敏度和測定范圍要求極高，也正因?yàn)槿绱耍?RT-qPCR是目前應(yīng)用于血清miRNA定量最靈敏的技術(shù)。qPCR定量法WDNA在PCR擴(kuò)增的循環(huán) 數(shù)來間接地反映初始DNA/RNA的濃度，有兩種報(bào)道方式：相對定量的擴(kuò)增倍數(shù)和拷貝數(shù)的 絕對定量。前者需要在樣本中同時(shí)測定目標(biāo)miRNA和可W作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)的恒定表達(dá)的RNA, W二者間的循環(huán)數(shù)之差，來衡量目標(biāo)miRNA的濃度差異。后者需要進(jìn)一步對獨(dú)立測定的系 列稀釋的合成RNA片段進(jìn)行測定，得到校正曲線，從而獲得待測物的絕對分子拷貝數(shù)目。前 者可W通過對內(nèi)參RNA的同時(shí)測定來排除樣本雜質(zhì)對PCR效率的影響，但迄今還沒能發(fā)現(xiàn) 理想的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)。后者可W給出更易于理解的miRNA拷貝數(shù)，但需要分別測定的校正曲線 進(jìn)行勘校，不能排除樣本雜質(zhì)對PCR效率的影響，因此也對純化RNA的質(zhì)量要求極高，難于 大規(guī)模應(yīng)用和客觀重復(fù)。
[0008]RNA提取步驟給循環(huán)miRNA定量測定造成很大的誤差和不確定性。McDonald等人 測定RNA純化步驟對相同血清樣本含量頗豐的miR-15b、miR-16、miR-24的定量結(jié)果的誤 差達(dá)到1倍W上（McDonald, 2011)。不同個(gè)體或不同處理的血清樣本更會對定量結(jié)果產(chǎn)生 不可預(yù)估的影響。RNA提取步驟帶來的測定誤差，也與提取的方法和不同商家的提取試劑 盒有關(guān)?；痷net-Vega等人分析了用5種RNA提取試劑盒分離純化的血漿RNA中miR-18a/ miR-21/miR-29a的含量，盡管PCR步驟的重復(fù)性很好，不同樣本間參入的合成RNA參照物的 測定誤差超出了容忍的范圍，總有一些miRNA的PCR擴(kuò)增效率受到不同程度的影響，掲示了 使用外源合成RNA參照物衡量血漿miRNA水平的難度度runet-Vega，2015)。
[000引循環(huán)miRNA定量測定結(jié)果的客觀性和重復(fù)性，受到樣本類型、個(gè)體差異、RNA提純 及所使用的miRNA測定技術(shù)平臺的影響。miRNA定量檢測方法的客觀性、靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)化是 將研究成果轉(zhuǎn)化為臨床疾病診斷應(yīng)用的瓶頸和關(guān)鍵，對過去8年循環(huán)miRNA研究結(jié)果的總 結(jié)，一致認(rèn)為miRNA的測定技術(shù)尚不能滿足臨床診斷的需求。
[0010] 為了抗衡RNA純化、樣本質(zhì)量及機(jī)器、操作、耗材等外在因素對miRNA測定結(jié)果的 影響，本申請的發(fā)明人開發(fā)了通過DNA片段長度多態(tài)性巧光定量分析來完成miRNA的分子 數(shù)絕對定量檢測的方法（即miRFLP定量分析法）。miRFLP測定法，采用歐米伽引物對樣品 中miRNA和內(nèi)置RNA標(biāo)準(zhǔn)在同一反應(yīng)管中進(jìn)行同時(shí)檢測，由同步測得的標(biāo)準(zhǔn)分子數(shù)量為動 態(tài)定量的標(biāo)準(zhǔn)尺度，獲得待測miRNA的相對峰值，從而濾掉樣本雜質(zhì)和RNA片段對反應(yīng)效率 的影響，通過對比實(shí)測的標(biāo)準(zhǔn)曲線而得到miRNA絕對拷貝數(shù)。運(yùn)樣做，對RNA純度的要求大 大降低，可對未經(jīng)純化的樣本中少至10個(gè)拷貝數(shù)的目標(biāo)miRNA進(jìn)行直接測定，實(shí)現(xiàn)對miRNA 的客觀定量測定，參見中國專利申請CN2014103626962，CN2012101083125。但運(yùn)樣的操作， 不能像純化RNA那樣對樣本產(chǎn)生富集作用，上樣量僅為0. 4μ1，經(jīng)過PCR反應(yīng)前的稀釋，實(shí) 際測定樣本體積僅為0.02μ1，產(chǎn)生較大的測定誤差，限制了方法的應(yīng)用。
[0011] 免抽提miRFLP測定法也可直接用于對細(xì)胞或血漿裂解液中游離miRNA和蛋白 質(zhì)復(fù)合物中的miRNA進(jìn)行定量測定，但是，健康人每微升血漿miR-122含量僅為數(shù)百個(gè)， miRFLP直接測定法需要對樣本進(jìn)行稀釋W(xué)降低3'適配寡聚核巧酸引物對RT及PCR反應(yīng)的 影響。miRFLP直接測定法的實(shí)際測定最大樣本量為0. 02μ1，在412個(gè)分子水平時(shí)，miR-122 的測定變動范圍為21. 7%，因此方法靈敏度和測定誤差范圍均有待提高。細(xì)胞產(chǎn)生的分 泌泡也經(jīng)血液進(jìn)行代謝，分泌泡內(nèi)含有對病理狀態(tài)更具診斷意義的生物標(biāo)記物。細(xì)胞分泌 泡包含各種細(xì)胞組份，有RNA、蛋白質(zhì)、miRNA前體等，也包括受蛋白質(zhì)復(fù)合物保護(hù)的成熟 miRNA。由于受細(xì)胞膜的保護(hù)，免抽提miRFLP測定法無法測定細(xì)胞分泌泡里面的miRNA。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的就在于提供一種改進(jìn)的miRFLP測定方法，W解決上述問題。
[0013] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是運(yùn)樣的：一種直接對miRNA進(jìn)行絕 對定量檢測的方法，采用miRFLP法，其步驟包括：將待測miRNA樣本與動態(tài)miRNA標(biāo)準(zhǔn)混合 均勻，然后經(jīng)過miRNA逆轉(zhuǎn)錄、cDNA加尾、PCR同步擴(kuò)增及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光片段長度多 態(tài)性分析，在所述cDNA加尾步驟中，對適配寡聚核巧酸鏈3'末端進(jìn)行修飾。
[0014] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案：對待測樣本進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理采用的預(yù)處理試劑為 10%或90%的二甲基亞諷，預(yù)處理方式為室溫解育或加熱處理。具體方法為：將待測miRNA 樣本與預(yù)處理試劑混合，室溫解育或加處理，然后再與動態(tài)miRNA標(biāo)準(zhǔn)混合。
[0015] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案：所述對適配寡聚核巧酸鏈3'末端進(jìn)行修飾的方法為碳鏈 修飾或氨基修飾或增加一個(gè)與所述適配寡聚核巧酸鏈序列相同的寡聚核巧酸鏈。
[0016] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案：對miRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及PCR反應(yīng)物進(jìn)行富集。
[0017] 作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案：富集時(shí)采用生物素-瓊脂糖鏈霉素偶聯(lián)試劑或鏈霉 素磁珠。
[001引作為優(yōu)選的技術(shù)方案：所述待測miRNA樣本為含有miR-122的樣本。