一種沙門氏菌的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專利說明】-種沙口氏菌的核酸恒溫?cái)U(kuò)増檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法 (-)技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種針對(duì)沙口氏菌核酸的恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)技術(shù)，適合對(duì)沙口氏菌的 定性檢測(cè)。 (二）【背景技術(shù)】
[0002] 沙口氏菌廣泛存在于自然界，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的血清型就有2500種W上，我國已發(fā) 現(xiàn)216個(gè)。與人類疾病有關(guān)的血清型主要集中于A~E群，包括：傷寒沙口氏菌、甲、乙、丙型 副傷寒沙口氏菌、鼠傷寒沙口氏菌、豬霍亂沙口氏菌、腸炎沙口氏菌、鴨沙口氏菌、新港沙口 氏菌等，其中W鼠傷寒沙口氏菌、腸炎沙口氏菌及豬霍亂沙口氏菌最為常見。沙口氏菌引起 的食物中毒在日本、歐美占首位，亦是我國細(xì)菌性食物中毒的常見菌。在我國內(nèi)陸地區(qū)，有 70%~80%細(xì)菌性食物中毒是由沙口氏菌引起的，是對(duì)人類和動(dòng)物健康有極大危害的一類 食源性病原菌。
[0003] 沙口氏菌的傳統(tǒng)檢測(cè)多采用細(xì)菌培養(yǎng)、生化和血清學(xué)鑒定等方法，此類方法操作 繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、所需試劑繁多，經(jīng)濟(jì)成本高。隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)在已建立 了W抗原為主的免疫學(xué)檢測(cè)方法如化ISA法，W及WPCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)。ELISA操作 較為繁瑣，費(fèi)時(shí)較長；PCR檢測(cè)方法快捷，靈敏，準(zhǔn)確度較高，但是需要一定的設(shè)備和技術(shù)要 求，且試劑費(fèi)用較貴，難W推廣普及。為了實(shí)現(xiàn)基層能廣泛進(jìn)行腸炎沙口氏菌的快速檢測(cè)， 有效防控該類細(xì)菌引起的食物中毒，建立實(shí)用、簡便、快速、準(zhǔn)確的腸炎沙口氏菌檢測(cè)方法 十分必要。
[0004] 近年來，LAMP方法受到關(guān)注，該方法W特定核酸為目標(biāo)在等溫條件下通過有鏈置 換酶活性的DNA聚合酶作用而擴(kuò)增，具有特異性高、靈敏性強(qiáng)，而且簡便快速成本低廉的特 點(diǎn)。已在微生物檢測(cè)等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。本發(fā)明技術(shù)研制了恒溫?cái)U(kuò)增沙口氏菌核酸，并 結(jié)合核酸試紙條顯色來判定結(jié)果的檢測(cè)方法，且整個(gè)反應(yīng)過程不打開反應(yīng)管蓋子，試紙條 流動(dòng)檢測(cè)過程密閉，杜絕了核酸擴(kuò)增產(chǎn)物污染外界的可能性。研究表明該沙口氏菌恒溫?cái)U(kuò) 增-核酸試紙條檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、敏感度高、對(duì)儀器要求簡單、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)， 所W非常適用在基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)使用，同時(shí)在突發(fā)公共衛(wèi)生事件的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)與臨床上的床邊 診斷上也具有很好的應(yīng)用前景。 (Ξ)
【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]本發(fā)明目的是提供一種準(zhǔn)確、靈敏、快速地檢測(cè)沙口氏菌核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試 劑盒及其檢測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明提供一種沙口氏菌的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括如下組 成：
[0008] (l)DNA提取試劑（優(yōu)選Takara公司的BacterialGenomicDNAExtraction Kit(貨號(hào)DV810A);
[0009] (2)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液，包括：正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、兩條交叉擴(kuò) 增引物、lX化ermolbuffer、M拆04、dNTPs溶液、BstDNA聚合酶和無菌雙蒸水；其中：
[0010] 所述的外圍引物分別為：
[0011] 所述正向外圍引物為：5' -AACAGTGCTCGTTTACGACC-3'(沈QIDNO. 2); 陽01引 反向外圍引物為：5' -CTGATCGATAATGCCAGACG-3'(沈QIDNO. 3);
[0013] 所述兩條探針的序列分別為：
[0014] 正向 5'端Biotin標(biāo)記探針：5' -Biotin-AGGTAGGTAATGGAATGACGA-3'(沈QID NO. 4)；
[0015]反向 5'端Fite標(biāo)記探針 5' -Fitc-CGTTCTACATTGACAGAATCCTCAG-3'(SEQID NO. 5)；
[0016] 所述兩條擴(kuò)增交叉引物分別為：
[0017] 擴(kuò)增正向引物： 陽0化]5 ' -GCGATCAGGAAATCAACCAGATAGAATGGTGATGATCATTTCTATGTTC-3 '(沈QID NO.6)；
[0019] 擴(kuò)增反向引物：
[0020] 5f-CGTACTGGCGATATTGGTGTTTATATTMCAGTACCGCAGGAAAC-3f(沈QIDNO. 7); 陽02U做陽性對(duì)照冶有沙口氏菌invA基因片段的DM質(zhì)粒； 陽0巧 （4)陰性對(duì)照巧菌雙蒸水。
[0023] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述的1XThermolbuffer組成為：20mM的Tris-肥1、lOmM的 KCl、10mM的（NH4)2S〇4、2mM的Μ拆〇4^及質(zhì)量濃度為 0. 1% 的TritonX-100，pH7. 5。
[0024] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述陽性對(duì)照為含有長238bp的沙口氏菌invA基因序列的片段， 所述片段的核巧酸序列如下（SEQIDNO. 1): 陽0巧]AACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGTACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCGTC ATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTC GTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCAT TATCGATCAGTACCA
[00%] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述陽性對(duì)照按如下步驟制備：
[0027]W包含擴(kuò)增區(qū)域的沙口氏菌invA基因片段為模板，通過兩條外圍引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增獲得目的基因；利用PCR純化試劑盒（Promega)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；將純化后的擴(kuò) 增產(chǎn)物通過T-easy質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒（Promega)構(gòu)建完整的含有目的基因的質(zhì)粒序列，用分 光光度計(jì)對(duì)所抽提的質(zhì)粒測(cè)A2S。定量并10倍稀釋，-2(TC保存。
[0028] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液組成為：兩條外圍引物各自1化mol,兩條探 針各自 20pmol，兩條交叉引物各自 40pmol，lXThe;rmolbuffer,Μ拆〇4為6mmol，dNTPs溶 液各0. 4mmol，BstDM聚合酶8U，無菌雙蒸水組成補(bǔ)足至25μ1。
[0029] 本發(fā)明還提供一種所述沙口氏菌的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方 法為： W30]a)用DNA提取試劑從待檢測(cè)的標(biāo)本中提取DNA;
[0031]b)將步驟a)提取得到的DNA作為模板加入到裝有恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中，在 65°C下擴(kuò)增反應(yīng)35分鐘；標(biāo)準(zhǔn)陽性模板（即陽性對(duì)照）加入陽性對(duì)照PCR管中，標(biāo)準(zhǔn)陰性 模板（即陰性對(duì)照）加入陰性對(duì)照PCR管中，所述標(biāo)準(zhǔn)陽性模板為含有沙口氏菌invA基因 片段的質(zhì)粒，所述標(biāo)準(zhǔn)陰性模板為無菌雙蒸水；
[0032]C)將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸試紙條防污染檢測(cè)裝置（杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)公 司3號(hào)裝置）中進(jìn)行檢測(cè)，2分鐘W后判讀結(jié)果，當(dāng)試紙條的檢測(cè)線呈陽性時(shí)，說明樣品中含 有沙口氏菌核酸。該試紙條包括在帶有不干膠的襯墊上按順序設(shè)有樣品墊、有色顆粒結(jié)合 物墊和吸水濾紙墊，上述各部分在相鄰處部分重疊，纖維膜上設(shè)有檢測(cè)線和質(zhì)控線，其中有 色顆粒結(jié)合物墊上的有色顆粒有抗Fite抗體包被，檢測(cè)線上有親和素包被，質(zhì)控線上有抗 Fite抗體，有色顆粒選自膠體金顆粒、乳膠顆粒。
[0033] 在本發(fā)明提供的試劑盒中，有兩條外圍引物，兩條交叉引物和兩條檢測(cè)探針。本試 劑盒中的6條寡聚核巧酸序列依靠BstDNA聚合酶的高活性的鏈置換特性，使得鏈置換DNA 合成不斷的自我擴(kuò)增循環(huán)。在本發(fā)明提供的沙口氏菌核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒中，對(duì)不 同的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，如引物和探針的濃度，Mg2+濃度，反應(yīng)溫度等的優(yōu)化，并將本發(fā)明 與核酸檢測(cè)試紙條檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，建立了沙口氏菌核酸恒溫?cái)U(kuò)增定性檢測(cè)的方法。該試 劑盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出10個(gè)拷貝，可W滿足快速檢測(cè)沙口氏菌核酸的要 求。
[0034] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有W下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[00對(duì) （1)本發(fā)明所述沙口氏菌的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的特異性好，靈敏度高，步驟 簡單，可重復(fù)性高；
[0036] (2)反應(yīng)速度快，單個(gè)樣本從樣本處理到完成檢測(cè)，僅需1小時(shí)左右；
[0037] 做整個(gè)擴(kuò)增和檢測(cè)過程中不需要打開PCR管蓋，減少了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)；整 個(gè)反應(yīng)過程不需要復(fù)雜的儀器。 (四）
【附圖說明】
[0038] 圖1為核酸檢測(cè)試紙條原理示意圖。
[0039] 圖2為本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)沙口氏菌的特異性結(jié)果，圖中1-13分別表示傷寒沙 口氏菌CMCC50071、鼠傷寒沙口氏菌CMCC50115、福氏志賀氏菌CMCC51572、銅綠假單胞 桿菌（綠脈桿菌）ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希氏菌ATCC25922、陰 溝腸桿菌ATCC13047、副溶血性弧菌ATCC17802、空腸彎曲菌ATCC33291、單增李斯特氏 菌ATCC19111、艱難梭菌ATCC9689、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 W40] 圖3為本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)沙口氏菌的靈敏度，圖中1-6分別表示104拷貝/微 升、1〇3拷貝/微升、102拷貝/微升、101拷貝/微升、10°拷貝/微升、陰性對(duì)照品的實(shí)驗(yàn)結(jié) 果。 (五）
【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0042] 實(shí)施例1本發(fā)明試劑盒的組成與配制
[0043]a)DNA提取試劑（優(yōu)選Takara公司的BacterialGenomicDNAExtraction Kit(貨號(hào)DV810A);
[0044] b)沙口氏菌核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液：兩條外圍引物（1化mol)，兩條探針（2化mol)和 兩條交叉引物（40pmol)，lXT