一種鑒定三帶喙庫蚊的實時熒光pcr引物和探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于昆蟲鑒定技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，設(shè)及一種用于海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭 庫蚊鑒定的實時巧光PCR引物和探針及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] Ξ帶瞭庫蚊（化lex tritaeniorhynchus)屬雙翅目蚊科庫蚊屬庫蚊亞屬海濱庫蚊 組海濱庫蚊亞組，兼吸人和動物血，是流行性乙型腦炎的主要傳播媒介。主要分布：國內(nèi)除 新疆、西藏未見記錄，分布于全國各地；國外分布于己基斯坦、印度、孟加拉國、斯里蘭卡、細(xì) 甸、泰國、柬捕寨、越南、馬來西亞、新加坡、印度尼西亞、菲律賓、日本、朝鮮、原蘇聯(lián)、中東、 東非等。
[0003] 海濱庫蚊亞組蚊種包括：海濱庫蚊、Ξ帶瞭庫蚊、白霜庫蚊、環(huán)帶庫蚊、偽雜鱗庫 蚊等，主要鑒定特征是翅無顯著的黑白斑，但雄蚊尾器結(jié)構(gòu)復(fù)雜，同一亞組形態(tài)特征極為接 近，鑒定難度大。Ξ帶瞭庫蚊是該亞組中具有重要醫(yī)學(xué)意義的蚊種，主要鑒別特征：頭頂豎 鱗暗而平齊；盾鱗暗棟呈花椒色；雄蚊觸須第3節(jié)腹面有一行垂毛；雌蚊食竇甲齒纖維狀； 后股末端黑環(huán)很窄；幼蟲7-I分2芒枝；巧齒末端圓而有鍵。但受限于鑒定人員的經(jīng)驗積 累，僅憑形態(tài)學(xué)鑒定將Ξ帶瞭庫蚊與同一亞屬蚊種進行鑒別需要有豐富經(jīng)驗；同時在捕獲 不同發(fā)育階段蚊種時，需培養(yǎng)至成蟲進行鑒定，耗時較長；因采集工具等原因破壞標(biāo)本的完 整性，給形態(tài)學(xué)鑒定帶來更大困難。
[0004] 傳統(tǒng)媒介蚊種形態(tài)學(xué)鑒定方法存在著鑒定專家數(shù)量有限、鑒定周期長、鑒定效率 低等問題，隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，基于DNA序列的物種分子鑒定技術(shù)應(yīng)運而生，該技 術(shù)不受蚊蟲發(fā)育階段和性別限制，且只需一部分組織提取到足夠量的核酸也可進行分類 鑒定，成為傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的重要補充。蚊類分子鑒定技術(shù)主要包括W下幾種方法：1、限 制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymo巧hism，RFLP)，結(jié)果穩(wěn)定可 靠，重復(fù)性好，但靈敏度不高，不易自動化；2、隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)（RandomAmplified PolymorphicDM,RAPD)，技術(shù)簡單，檢測速度快，但實驗的穩(wěn)定性和重復(fù)性差；3、基于PCR 技術(shù)擴增基因組DNA限制性片段（amplifiedfragmentlengthpolymo;rphism)，兼具RAPD 與RFLP的優(yōu)點，有較高穩(wěn)定性，但對基因組制備純度要求較高；4、DNA忍片技術(shù)，用于多種 分子標(biāo)記檢測，但設(shè)備和檢測成本較高；5、DNA測序技術(shù)，結(jié)果直觀可靠，可對傳統(tǒng)分類有 疑問的類群或形態(tài)分類不能解決的問題進行分析探討，也可對傳統(tǒng)分類系統(tǒng)進行驗證，但 也存在成本較高，耗時較長問題；6、PCR和巧光PCR技術(shù)，通過擴增特異性片段進行物種鑒 定，操作簡便，成本較低，但找到適用的物種特異性DNA片段是難點。
[0005] LydiaA.化11等建立快速鑒定白紋伊蚊、埃及伊蚊和盾蚊伊蚊實時巧光PCR方 法，適用于蚊發(fā)育各個階段的鑒定。與普通PCR相比，巧光PCR具有靈敏度高、特異性強、操 作簡便、檢測時間短等優(yōu)點。同時巧光PCR的擴增和產(chǎn)物分析都在一封閉的管中進行，較之 傳統(tǒng)的PCR方法大大減少了污染的幾率，也具有較好的生物安全性。對于Ξ帶瞭庫蚊的巧 光PCR鑒定方法還未有報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服形態(tài)學(xué)鑒定海濱庫蚊亞組蚊種鑒定難題，提供一 種一種快速、準(zhǔn)確、特異性高、敏感性強的鑒定海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭庫蚊的實時巧光PCR 方法和試劑盒。
[0007] 本發(fā)明的目的是提供上述實時巧光PCR的引物、MGB探針和檢測方法。
[0008] 本發(fā)明上述目的通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)：本發(fā)明所述的一種用于海濱庫蚊亞組中 立帶瞭庫蚊鑒定的巧光PCR引物和探針，其特征在于，所述引物包括上游引物化lex-F和下 游引物Culex-R，上游引物Culex-F由沈QIDNO. 1所示的序列，下游引物Culex-R由沈QID NO. 2所示的序列；所述探針為Tritaeniorhynchus-P探針，探針Tritaeniorhynchus-P由 沈QIDNO. 3所示的序列。巧光PCR上游引物化lex-F為沈QIDNO. 1所述的序列：5'-ΤΤ CAAGTAGTTTAGTAGAAAATGGAGC-3';巧光PCR下游引物Culex-R為沈QIDNO. 2 所述的序列： 5，-TGTAAAGAAAAAATAGCTAAATCAACTG-3，；巧光PCR探針Tritaeniorhynchus-P為沈QID NO. 3 所述的序列：FAM-5' -ACAGTTTATCCACCTCT-3' -MGB。
[0009] 所述探針Tritaeniorhynchus-P的5'端標(biāo)記有FAM，3'端標(biāo)記有非巧光澤滅基團 NFQ和MGB。
[0010] 本發(fā)明所述Ξ帶瞭庫蚊實時巧光PCR引物和探針在鑒定Ξ帶瞭庫蚊方面的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明所述Ξ帶瞭庫蚊實時巧光PCR引物和探針在制備Ξ帶瞭庫蚊鑒定試劑或 試劑盒中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明所述的一種用于海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭庫蚊鑒定的巧光PCR檢測方法，其 PCR反應(yīng)所用的引物和探針為權(quán)利要求1所述的引物和探針。
[001引本發(fā)明所述的PCR反應(yīng)體系為：5μL模板DNA，10ymol/L上游引物Culex-F0. 625μL10μmol/L下游引物Culex-R0. 5μL10μ°Cmol/L巧光探針 Tritaeniorhynchus-P1. 25μL2X實時巧光PCR預(yù)混試劑和余量(1地20,共 25μL; PCR反應(yīng)程序為：預(yù)變性94°C2min;94°C5s，58°C45s，共40個循環(huán)；58°C收集巧光信 號；根據(jù)擴增曲線、Ct值確定檢測結(jié)果的陰性和陽性； 其中，實時巧光PCR預(yù)混試劑包含有實時巧光PCR反應(yīng)所需要的DNA聚合酶、緩沖液和 dNTPo
[0014] 本發(fā)明所述的一種用于海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭庫蚊鑒定的試劑盒，包括：權(quán)利要 求1或2所述的上游引物Qilex-F和下游引物Qilex-R，W及Tritaeniorhynchus-P探針， 實時巧光PCR反應(yīng)體系中的DNA聚合酶、巧光PCR預(yù)混試劑，其中巧光PCR預(yù)混試劑包含有 實時巧光PCR反應(yīng)所需要的緩沖液和dNTP。
[0015] 上述的單份25μL的實時巧光PCR反應(yīng)體系使用的DM聚合酶量為0. 5~1U;單份 25μL的實時巧光PCR反應(yīng)體系中各dNTP的終濃度為0. 2mmol/L。
[0016] 本發(fā)明公開一組用于海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭庫蚊的實時巧光PCR引物和探 針，所述引物包手上游引物化lex-F和下游引物化lex-R，上游引物化lex-F的序列 如SEQIDNO. 1所示，下游引物化lex-R的序列如SEQIDNO. 2所示；所述探針為 Tritaeniorhynchus-P，MGB探針Tritaeniorhynchus-P的序列如沈QIDNO. 3 所示。
[0017] 其中所述探針Tritaeniorhynchus-P的5'端有報告巧光基團FAM，3'端為非巧光 澤滅基團和MGB修飾基團。
[0018] 上述鑒定海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭庫蚊的實時巧光PCR引物和探針在鑒定Ξ帶瞭 庫蚊方面的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0019] 上述鑒定海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭庫蚊的實時巧光PCR引物和探針在制備鑒定Ξ 帶瞭庫蚊試劑或試劑盒方面的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0020] 應(yīng)用時，所述引物的優(yōu)選退火溫度為58°C。
[0021] 本發(fā)明還W上述引物和探針建立了一種鑒定海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭庫蚊的實時 巧光PCR方法。
[002引PCR反應(yīng)體系為：5μL模板DNA，10μmol/L上游引物Culex-F0. 625μL，lOymol/L下游引物Qilex-R0. 5yL10ymol/L巧光探針Tritaeniorhynchus-P 1. 25μL2X實時巧光PCR預(yù)混試劑和余量(1地20,共25μL。
[0023]PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性 95°C30s;95°C5s，58°C45s，共 40 個循環(huán)。
[0024] 其中，所述實時巧光PCR預(yù)混試劑為商品化的寶生物(大連)有限公司的PremixEx TaqΤΜ(ProbeqPCR)試劑，包含有實時巧光PCR反應(yīng)所需要的DM聚合酶、緩沖液和dNTP。 PCR反應(yīng)程序根據(jù)所選用試劑不同可進行調(diào)整。
[00巧]另外，上述引物和探針構(gòu)建的Ξ帶瞭庫蚊鑒定試劑盒也在本發(fā)明保護范圍之內(nèi)。
[0026] 在實際應(yīng)用工作中，利用本發(fā)明所設(shè)計的引物和探針鑒定Ξ帶瞭庫蚊，大致工作 流程如下：首先提取待測樣品DNA，再利用本發(fā)明設(shè)計的引物和探針或本發(fā)明建立的實時 巧光PCR方法進行檢測。對于待測樣品DNA沒有特殊的要求，按照本領(lǐng)域常規(guī)方法提取到 的樣品DNA均可用于檢測。
[0027] 本發(fā)明具有W下有益效果： 本發(fā)明公開了一組鑒定海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭庫蚊的實時巧光PCR引物和探針，能快 速、準(zhǔn)確地從海濱庫蚊亞組蚊種中鑒定出重要醫(yī)學(xué)媒介--Ξ帶瞭庫蚊，具有良好地特異性 和敏感性。
[0028] 1.結(jié)果可靠，敏感性高：本方法與Ξ帶瞭庫蚊形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果完全一致，對海濱 庫蚊復(fù)合組其它蚊種無交叉反應(yīng)，結(jié)果穩(wěn)定可靠；可取單只蚊腿提取DNA進行檢測，具有較 高的敏感性。
[0029] 2.操作簡單、節(jié)省時間：本發(fā)明應(yīng)用實時巧光PCR對蚊基因進行鑒定，操作簡單， 整個實驗過程在化內(nèi)完成，適用于蚊生活史各個階段鑒定，無需培養(yǎng)至成蟲，節(jié)省時間。
[0030] 3.實驗可由一般技術(shù)人員操作，無需媒介鑒定專家在場，可W快速地從海濱庫蚊 亞組中鑒定出Ξ帶瞭庫蚊，解決海濱庫蚊復(fù)合組蚊種鑒定難題，對殘缺標(biāo)本也可進行鑒定， 具有良好地應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[003。圖1是1~7號樣本實時巧光PCR靈敏度試驗結(jié)果圖，圖中：1 - 7依次 為 1XlO'copies/μL、IXl06copies/μL、1Xl05copies/μL、IXl04copies/μL、 1Xicfcopies/μL1Xl02copies/μLlOcopies/μL;8:陰性對照；9 :陽性對照。
[003引圖2是實時巧光PCR重復(fù)性試驗結(jié)果圖，圖中：1為陽性對照，2-9為 1Xicfcopies/μL質(zhì)粒重復(fù)性試驗，10為陰性對照。
[0033] 圖3是實時巧光PCR特異性試驗結(jié)果圖。