一種荔枝霜疫霉菌lamp引物及其快速檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種荔枝霜疫霉菌LAMP引物及其快速檢測方法，專用于荔枝霜疫霉菌高靈敏度快速分子檢測，同時可用于田間荔枝霜疫霉病的早期診斷和病菌的監(jiān)測和鑒定，屬于農(nóng)作物病害檢測、鑒定及防治技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]荔枝霜疫霉病是我國荔枝產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生且危害嚴重的病害，其病原菌為荔枝霜疫霉售i iperonophythora litchii)0該病于1978年在我國臺灣首次報道，目前在廣東、廣西、福建、海南臺灣等地均有發(fā)生，不僅嚴重為害接近成熟的果實，也為害嫩梢、葉片、花穗、結(jié)果小枝、果柄及幼果，引起大量落花、落果、裂果和爛果，產(chǎn)量損失高達80%以上，甚至絕收，是造成荔枝長期單產(chǎn)低且不穩(wěn)產(chǎn)的主要原因之一，此外，該病在荔枝果實貯運期仍繼續(xù)危害，嚴重影響產(chǎn)量、品質(zhì)以及鮮果的儲運和外銷，造成巨大的經(jīng)濟損失，影響荔枝產(chǎn)業(yè)可持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。
[0003]目前對荔枝霜疫霉病的檢測大多仍沿用傳統(tǒng)培養(yǎng)和血清學(xué)鑒定方法。傳統(tǒng)荔枝霜疫霉菌的分類鑒定主要是基于形態(tài)學(xué)特征、致病性測定、生理生化特性等，程序繁瑣，所需時間較長且靈敏度較低，鑒定時還易受人為及環(huán)境等諸多因素的干擾，而且不能直接從植物組織中檢測出病原菌，難以滿足病害控制中快速、靈敏、穩(wěn)定的檢測要求，很容易錯過病害防治的最佳時期，而免疫血清學(xué)鑒定方法雖已建立，但是血清的制備過程耗時耗力，常常受到抗血清質(zhì)量的影響，且可能存在交叉反應(yīng)，特異性較差，容易造成假陽性，因此這些方法的應(yīng)用均受到一定的限制。
[0004]PCR技術(shù)為植物病原診斷提供了快速、靈敏、準確的優(yōu)勢，但由于目前PCR檢測技術(shù)仍然需要PCR儀、電泳和凝膠成像系統(tǒng)等昂貴的專業(yè)儀器和分子生物學(xué)試劑，且需要分子生物學(xué)專業(yè)實驗人員操作，限制了該檢測方法的推廣應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplificat1n, LAMP)具有簡單、快速、高效、經(jīng)濟等特征。該技術(shù)可在60°C~65°C恒溫條件下，利用高活性的鏈置換DNA聚合酶DNApolymerase)對目的DNA片段進行特異性擴增。在1個小時內(nèi)，能夠?qū)⑸倭靠截悢?shù)的目的基因擴增至109個拷貝數(shù)。LAMP反應(yīng)產(chǎn)物不僅可以通過濁度儀、real-time PCR儀及凝膠電泳儀進行檢測，而且還可以通過SYBR Green 1、鈣黃綠素、羥基萘酚藍染色后，肉眼識別。由于LAMP反應(yīng)簡單、快速、高效、經(jīng)濟等特征，因而具有極為廣泛的應(yīng)用前景。目前LAMP檢測主要應(yīng)用于人畜病原物、食品安全和環(huán)境衛(wèi)生的檢測，在植物病原菌檢測中報道較少，關(guān)于荔枝霜疫霉菌的LAMP檢測國內(nèi)外均未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中荔枝霜疫霉菌的生物學(xué)檢測方法所需周期長、檢測方法特異性差，靈敏度低的問題，提供一種荔枝霜疫霉菌的LAMP檢測引物以及結(jié)果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高的荔枝霜疫霉菌的快速檢測方法。
[0006]實現(xiàn)本發(fā)明的目的包括下列步驟:
1.LAMP引物的設(shè)計
對荔枝霜疫霉菌序列進行擴增、克隆、測序，獲得的荔枝霜疫霉菌7/^7序列，應(yīng)用在線 LAMP 引物設(shè)計軟件primer software PrimerExplorer V4 (http: //primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index, html; Eiken Chemical C0., Japan)設(shè)? 套LAMP檢測引物，包括1對外引物(F3和B3)和1對內(nèi)引物(FIP和BIP)，引物序列分別為:
外側(cè)引物:
F3:5’ -CCGTACGATCGAGCTGGA-3’ ；
B3:5’ -CCGTCACGTCGTACACCA-3’ ；
內(nèi)側(cè)引物:
FIP:5’ -TCGACTCAAGGTTACAGAACGCTGCAAGACCATCAAGCTCCA-3’ ；
BIP:5’ -GTGCTTTTATAGTGGGACACCGCCGCGGTAGTAGCTGCTAGT-3’ ；
2.荔枝霜疫霉菌快速檢測體系的建立
所述的LAMP反應(yīng)體系為25.0 4 1^包括？3與83各0.2卜]\1，F(xiàn)IP與BIP各1.6μΜ，1 X Thermopol Buffer, 1.0 mM dNTPs, 0.8 M 甜菜喊，6.0 mM 硫酸儀，0.1% Tween-20,
8 U DNA聚合酶為，50 ng模板DNA，50 μΜ鈣黃綠素，500 μΜ氯化錳，不足部分用無菌雙蒸水補足。
[0007]所述的LAMP反應(yīng)條件為在63°C溫育60 min，80°C保溫5min。
[0008]所述的檢測方法為熒光染料目測觀察法和瓊脂糖凝膠電泳法。所述熒光染料目測觀察法:在LAMP反應(yīng)體系中以50 μ Μ鈣黃綠素-500 μ Μ氯化錳為顯色劑，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橘黃色判斷為陰性。所述瓊脂糖凝膠電泳法:取2uL LAMP產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)擴增條帶判斷為陰性。
[0009]該方法可用于帶菌植株的高靈敏度快速檢測。建立荔枝霜疫霉菌快速、簡便、特異性強、靈敏度高的監(jiān)測技術(shù)體系，對于荔枝霜疫霉菌引起病害顯癥之前的早期監(jiān)測，確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義。
本發(fā)明的關(guān)鍵性技術(shù)是荔枝霜疫霉菌的高效特異擴增的引物序列及其擴增方法。為了驗證荔枝霜疫霉菌的特異引物序列，本發(fā)明以我國福建、廣東、廣西、臺灣等省的21株荔枝霜疫霉菌和其它13種不同卵菌及9種真菌為供試材料，采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA，具體方法如下:取0.lg冷凍干燥后的菌絲粉于5.0mL離心管中，加入2mL65°C預(yù)熱的2% CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取液(提取液的配方為:2% CTAB ；100 mmol/L Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)，pH 8.0 ；20mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)，pH8.0 ；1.4 mol/L NaCl)和0.2%巰基乙醇)充分混勻后，于65°C水浴lh，每10 min振蕩混勻一次。水浴結(jié)束后取出，放至室溫。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1)，充分顛倒混合，將提取液中含有的蛋白雜質(zhì)變性，分裝至2.0mL離心管中，室溫下12，OOOrpm離心lOmin。將上清液(水相)轉(zhuǎn)移到新1.5mL離心管中，向上清中加入1倍體積異丙醇，充分顛倒混勻，使DNA從溶液中析出，形成絮狀沉淀(可室溫或-20°C放置l-2h促進DNA沉淀)，4°C離心，12，OOOrpm, 20min。棄上清，加入500μ?70%乙醇洗滌，顛倒混勻，至沉淀懸起，4°C，12，OOOrpm離心5min。重復(fù)洗滌一次，棄酒精，在超凈工作臺上自然晾干無酒精味后加入適量無菌雙蒸水溶解DNA，DNA溶解后，按樣品體積加入1/10體積的 RNaseA (10mg/mL)并在 37°C處理 lOmin，去除 RNA，得到 DNA 溶液，用 NanoDrop 檢測 DNA濃度并稀釋備用。
[0010]經(jīng)對供試菌株和21株荔枝霜疫霉菌的特異性進行LAMP驗證。
[0011]LAMP反應(yīng)體系為 25 uL:包括F3 與 B3 各0.2μΜ，F(xiàn)IP與 BIP各 1.6μΜ，1 XThermopolBuffer, 1.0 mM dNTPs,0.8 M 甜菜堿，6.0 mM 硫酸鎂，0.1% Tween-20,
8 U DNA聚合酶為，50 ng模板DNA，50 μΜ鈣黃綠素，500 μΜ氯化錳，不足部分用無菌雙蒸水補足。
[0012]所述的LAMP反應(yīng)條件為在63°C溫育60 min，80°C保溫5min。
[0013]除了來自我國福建、廣東、廣西、臺灣等省的21株荔枝霜疫霉菌顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳檢測出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶，檢測了其它13種不同卵菌及9種真菌顯色結(jié)果為橘黃色或瓊脂糖凝膠電泳沒有出現(xiàn)擴增條帶。這說明該引物可被用于生產(chǎn)實踐中發(fā)病組織及土壤中荔枝霜疫霉菌快速可靠的檢測和鑒定。
[0014]當在用于荔枝組織中存在荔枝霜疫霉菌時，采用NaOH快速裂解法提取荔枝霜疫霉菌的DNA，具體過程如下:(1)將荔枝病葉或病莖洗凈、晾干，剪取發(fā)病部位；(2)按lmg病葉加入10uL (0.5mol/L NaOH,0.5%PVP)計量，將組織充分磨碎成糊，在12，000g離心機中離心5min ； (3)取上清20uL與等體積的0.1 mol/L的Tris-HCl (pH8.0)混合；(4)稀釋10倍、100倍、1000倍，分別取1 μ?原液、10倍、100倍、1000倍液作為LAMP模板進行等溫擴增。
[0015]按如下LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件用所設(shè)計的引物進行檢測:
① LAMP 反應(yīng)體系為 25 uL:包括 F3 與 B3 各 0.2μΜ，F(xiàn)IP 與 BIP 各 1.6μΜ，1 X ThermopolBuffer, 1.0 mM dNTPs,0.8 M 甜菜堿，6.0 mM 硫酸鎂，0.1% Tween-20,
8 U DNA聚合酶為，1 μ?模板DNA，50 μ Μ鈣黃綠素，500 μ Μ氯化錳，不足部分用無菌雙蒸水補足。
[0016]所述的LAMP反應(yīng)條件為在63°C溫育60 min，80°C保溫5min。
[0017]②LAMP反應(yīng)結(jié)束后，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光，或取2uL擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶，即可判斷所述的荔枝組織中存在荔枝霜疫霉菌；否則所述的荔枝組織中不存在荔枝霜疫霉菌。
[0018]本發(fā)明有益效果:本發(fā)明方法適用于發(fā)病組織中荔