一種用于同時檢測綿羊和山羊六種病毒的多重pcr試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種用于同時檢測綿羊和山羊攜帶的六種病毒的多重PCR試劑盒，具 體設及一種同時檢測綿羊和山羊藍舌病病毒、口蹄疫病毒、小反當獸疫病毒、綿羊痘病毒、 山羊痘病毒和羊口瘡病毒的多重PCR檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 多重PCR(multiplexPCR)是在普通PCR的基礎上加W改進，于一個PCR反應體 系中加入多對特異性引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴增多個目的片段的 PCR技術。多重PCR主要用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定和病原微生物、某些遺傳病 及癌基因的分型鑒定，其特點有：高效性，在同一PCR反應管內同時檢出多種病原微生物， 或對有多個型別的目的基因進行分型；系統(tǒng)性，多重PCR很適宜于成組病原體的檢測；經濟 簡便性，多種病原體在同一反應管內同時檢出，將大大的節(jié)省時間，節(jié)省試劑，節(jié)約經費開 支，為臨床提供更多更準確的診斷信息。
[0003] 藍舌病度luetongue，BT)是由呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬藍舌病病毒引起的通過 吸血昆蟲-庫朦叮咬傳播，感染牛羊等反當動物的一種非接觸性傳染病，全球已知至少有 24個不同血清型的BTV，不同血清型對牛羊的致病性不同，且型間不能產生交叉保護。藍舌 病主要感染反當動物牛、羊，表現為高燒、黏膜水腫和糜爛等癥狀，致死率為20 %~30%。 該病發(fā)病率高，傳播迅速，而又極難防制，被國際獸醫(yī)局列為A類傳染病。
[0004] 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的動物急性、烈性傳染病，主要危害牛、羊等偶蹄動 物，易感動物的發(fā)病率幾乎為100%。該病主要特點是流行廣、傳播快、發(fā)病率高，被國際獸 疫局列為A類傳染病之首，對畜牧業(yè)生產危害性極大，是世界各國檢測和防疫的重點對象。 陽0化]小反當獸疫（PPR)又稱羊攝，是由小反當獸疫病毒引起的山羊、綿羊等小反當動 物的一種急性、高度接觸性傳染病，牛感染但不發(fā)病。PPR對動物的致死率高達50%~ 90%，被世界動物衛(wèi)生組織（01巧列為A類傳染病，我國將其列為一類動物疾病，該病分布 于非洲、亞洲等地，在全球呈現由西向東擴散趨勢。
[0006] 綿羊痘是由痘病毒科（Poxciridae)脊椎動物痘病毒亞科（Qiordopoxvirdae)羊 痘病毒屬（Capripoxvirus)的綿羊痘病毒（Sheeppoxvirus,SPPV)引起綿羊的一種急性、 熱性、接觸性傳染病。主要表現為發(fā)熱、無毛或少毛部位皮膚黏膜發(fā)生丘疹和瘤疹，有較高 的死亡率。羊痘在非洲中北部、亞洲中部和西南部W及印度大部分地區(qū)呈地方性流行，對養(yǎng) 羊業(yè)造成嚴重的危害和巨大經濟損失。因而，被世界動物衛(wèi)生組織（01巧列為A類傳染病， 在我國也被列為一類傳染病。
[0007] 山羊痘（Goatpoxdisease)是由痘病毒科（Poxciridae)脊椎動物痘病毒亞科 (Qiordopoxvirdae)羊痘病毒屬（Capripoxvirus)的山羊痘病毒（Goatpoxvirus,GTPV) 引起山羊及綿羊的一種急性熱性高度接觸性傳染病，綿羊痘和山羊痘統(tǒng)稱羊痘，羊痘能導 致病羊消瘦，產乳量大幅度降低，嚴重時導致死亡，造成嚴重的經濟損失。因而羊痘被世界 動物衛(wèi)生組織（01巧列為A類傳染病，我國將其列為一類動物疾病。
[0008]羊口瘡（Soremouthdisease)又稱"羊傳染性脈瘤（Contagiousecthyma)"，是 由痘病毒科副痘病毒屬的傳染性脈瘤病毒（Contagiousecthymavirus)引起的綿羊、山羊 的一種急性、接觸性和嗜上皮性傳染病，可感染人類。主要危害黑羊，W口腔黏膜出現紅斑、 丘疹、水瘤，脈瘤，形成痛狀挪塊為特征。該病是一種常發(fā)疾病，會引起黑羊生長發(fā)育遲緩和 體重下降，給養(yǎng)羊業(yè)造成較大的經濟損失。 陽009] 藍舌病病毒、口蹄疫病毒、小反當獸疫病毒、綿羊痘病毒、山羊痘病毒和羊口瘡病 毒六種病毒可感染綿羊和山羊，感染運六種病毒中的一種后，病畜在臨床上均表現為精神 沉郁，體溫升高、口腔黏膜和乳頭等處發(fā)生水泡及潰瘍、黏膜水腫和糜爛等癥狀，而且臨床 癥狀極為相似，在臨床診斷上不易于區(qū)分。目前，對運六種疫病的診斷多采用病原分離鑒定 及常規(guī)的血清學方法，所需時間較長，普通PCR檢測需要不同的反應體系，耗時費力。因此， 亟需建立一種能同時、快速、精確檢測鑒別藍舌病病毒、口蹄疫病毒、小反當獸疫病毒、綿羊 痘病毒、山羊痘病毒和羊口瘡病毒六種病毒感染多重RT-PCR試劑盒。

【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明解決其技術問題采用的技術方案是，提供一種特異性強、敏感性高、操作簡 便快速的用于同時檢測藍舌病病毒、口蹄疫病毒、小反當獸疫病毒、綿羊痘病毒、山羊痘病 毒和羊口瘡病毒六種病毒核酸的多重PCR檢測試劑盒。
[0011] 本發(fā)明解決其技術問題采用的技術方案是，一種用于同時檢測綿羊和山羊攜帶的 六種病毒的多重PCR試劑盒，包括六對特異性引物，其中，用于藍舌病病毒檢測的引物分別 為BTV-F和BTV-R，引物序列分別為SEQIDNO: 1和SEQIDN0:2 ;用于口蹄疫病毒檢測的 引物分別為尸10￥斗和尸10￥-私引物序列分別為56〇10^:3和56〇10^:4;用于小反 當獸疫病毒檢測的引物分別為PPRV-F和PPRV-R，引物序列分別為SEQIDN0:5和SEQID N0:6 ;用于綿羊痘病毒檢測的引物分別為SPPV-F和SPPV-R，引物序列分別為SEQIDN0:7 和SEQIDN0:8 ;用于山羊痘病毒檢測的引物分別為GTPV-F和GTPV-R，引物序列分別為SEQ 10^:9和569 10^:10;用于羊口瘡病毒檢測的引物分別為03尸￥斗和01?尸￥-1?，引物序列 分別為沈QIDNO: 11和沈QIDNO: 12。
[0012] 進一步，所述多重PCR試劑盒還包括陽性對照、陰性對照、反轉錄液、PCR混合液、 去離子水。
[0013] 進一步，所述BTV-F、BTV-R、FMDV-F、FMDV-R、PPRV-F、PPRV-R、SPPV-F、SPPV-R、 GTPV-F、GTPV-R、0RFV-F、0RFV-R的摩爾比分別為 2 :2 :2 :2 :2 :2 :2 :2 :3 :3 :1 :1。
[0014] 進一步，所述BTV-F和BTV-R、FMDV-F和FMDV-R、PPRV-F和PPRV-R、SPPV-F和 SPPV-R、GTPV-F和GTPV-R、0RFV-F和0RFV-R六對引物在多重PCR擴增時的退火溫度為 54°C~60°C(優(yōu)選退火溫度為55°C)。
[0015] 進一步，所述引物BTV-F和BTV-R、FMDV-F和FMDV-R、PPRV-F和PPRV-R、SPPV-F 和SPPV-R、GTPV-F和GTPV-R、0RFV-F和0RFV-R在多重PCR反應體系中的終濃度分別為 1.Opmol/μL、1.Opmol/μL、1.Opmol/μL、1.Opmol/μL、1. 5pmol/μL、0. 5pmol/μL。
[0016] 本發(fā)明可同時檢測綿羊和山羊攜帶的六種病毒，檢測結果沒有交叉，可W達到對 綿羊和山羊藍舌病病毒、口蹄疫病毒、小反當獸疫病毒、綿羊痘病毒、山羊痘病毒和羊口瘡 病毒做到唯一檢測，特異性高，重復性好，靈敏度高，檢測過程簡便，檢測時間短，完全可W 滿足現有檢驗檢疫的需要，填補了國內空白。
【附圖說明】
[0017] 圖1為FMDV特異性引物驗證結果：M:DL2000Marker;1-5 :FMDV疫苗株。
[0018] 圖2為BTV特異性引物驗證結果：M:DL2000Marker;1-5BTV疫苗株。
[0019] 圖3為PPRV特異性引物驗證結果：M:DL2000Marker;1-5 :PPRV疫苗株。
[0020] 圖4為SPPV特異性引物驗證結果：M:DL2000Marker;1-5SPPV疫苗株。
[0021] 圖5為GTPV特異性引物驗證結果：M:DL2000Marker;1-5 :GTPV疫苗株。
[0022] 圖6為0RFV特異性引物驗證結果：M:DL2000Marker;1-5 :0RFV疫苗株。
[0023] 圖 7 為多重PCR特異性擴增結果。其中，Μ:DL1000Marker;1:PPRV;2:BTV;3 : SPPV；4：FMDV；5：GTPV；6：0RFV；7 ：PPRV+BTV+FMDV+SPPV+GTPV+ORFV；8：PPV；9：PRV；10 ： CSFV;11 :VER0 細胞；12 :BHK-21 細胞；13 :d地20。
[0024] 圖8為多重PCR敏感性結果。其中，Μ:DL1000Marker;1 :PPRVl〇7copies/ μL、BTVlO'copies/yL、FMDVlO'copies/yL、SPPVlO'copies/yL、GTPVlO'copies/ μL、ORFVlO'copies/μL;2 :PPRVl〇6copies/μL、BTVl〇6copies/μL、FMDVl〇6copies/ μL、SPPVl〇6copies/μL、GTPVl〇6copies/μL、ORFVl〇6copies/μL;3 :PPRVl〇5copies/ μL、BTVl〇5copies/yL、FMDVl〇5copies/yL、SPPVl〇5copies/yL、GTPVl〇5copies/ μL、ORFVl〇5copies/μL;4 :PPRVl〇4copies/μL、BTVl〇4copies/μL、FMDVl〇4copies/ μL、SPPVl〇4copies/μL、GTPVl〇4copies/μL、ORFVl〇4copies/μL;5 :PPRVl〇3copies/ μL、BTVl〇3copies/μL、FMDVl〇2copies/μL、SPPVl〇3copies/μL、GTPVlifcopies/μL、 ORFVl〇3copies/μL;6:PPRVl〇2copies/μL、BTVl〇2copies/μL、FMDVl〇2copies/μL、 SPPVl〇2copies/μLGTPVl〇2copies/μLORFVl〇2copies/μL。 陽0巧]圖9為多重PCR重復性結果。其中，Μ:DL1000Marker;1 :PPRVl〇6copies/μL、BTVl〇6copies/yL、FMDVl〇6copies/yL、SPPVl〇6copies/yL、GTPVl〇6copies/ μLORFVl〇6copies/μL第一次重復結果；2 :PPRVl〇5copies/μLBTVl〇5copies/μL FMDVl〇5copies/μL、SPPVl〇5copies/μL、GTPVl〇5copies/μL、ORFVl〇5copies/μL; 3 ::PPRVl〇4copies/yL、BTVl〇4copies/yL、FMDVl〇4copies/yL、SPPVl〇4copies/yL、 GTPVl〇4copies/yL、ORFVl〇4copies/yL;4-6 :第二次重復結果；7-9 :第Ξ次重復結果；10 : 陰性對照。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合實施例對本發(fā)明進一步加W說明。
[0027] 實施例1 :同時檢測綿羊和山羊攜帶的六種病毒的多重PCR試劑盒
[0028] 試劑盒包括六對特異性引物，還包括陽性對照、陰性對照、反轉錄液、PCR混合液、 去離子水。其中，用于藍舌病病毒檢測的引物分別為BTV-F和BTV-R;用于口蹄疫病毒檢 測的引物分別為FMDV-F和FMDV-R;用于小反當獸疫病毒檢測的引物分別為PPRV-F和 PPRV-R;用于綿羊痘病毒檢測的引物分別為SPPV-F和SPPV-R;用于山羊痘病毒檢測的引物 分別為GTPV-F和GTPV-R;用于羊口瘡病毒檢測的引物分別為0RFV-F和0RFV-R;
[0029] 用于藍舌病病毒檢測的引物是針對藍舌病病毒的NS3基因設計，引物序列分別為 BTV-F和BTV-R，
[0030] BTV-F:5' -AGTGTCATGCTATCCGCTGCC-3,；
[0031] BTV-R:5' -GCGTACATGCAGGATGCGAC-3' ；擴增片段大小為 25化p。
[0032] 用于口蹄疫病毒檢測的引物序列是針對口蹄疫病毒的3D基因設計，引物序列分 別為FMDV-F和FMDV-R， 陽的3] FMDV-F:5, -GGACCGAGAAGTTGATACAGA-3,；
[0034] FMDV-R:5' -CGCAGGTGTAAAGATCTGTAGC-3'