確定利用活性炭從包含靶蛋白的樣品去除病毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及確定活性炭是否可W用于從包含祀蛋白的樣品去除病毒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 用于純化祀蛋白如單克隆抗體的最常用的方法通常采用工程化的能夠表達祀蛋 白的細胞系（例如，哺乳動物或非哺乳動物細胞系）。運樣的祀蛋白可W分泌入細胞培養(yǎng) 基，或者其可W在細胞內(nèi)表達并在裂解表達該蛋白的細胞之后回收。
[0003] 祀蛋白通常需要進行一系列純化步驟W分離祀蛋白與各種雜質(zhì)，例如細胞、細胞 碎片、DNA、宿主細胞蛋白等。
[0004] 典型的純化方法通常需要使細胞培養(yǎng)進料或培養(yǎng)基（在分泌性祀蛋白的情況下） 或細胞裂解物（在細胞內(nèi)祀蛋白的情況下）進行各種步驟，包括一個或多個色譜步驟，W便 分離或純化祀蛋白。例如，在諸如單克隆抗體的分泌性祀蛋白的情況下，通常使細胞培養(yǎng)基 進行澄清步驟然后捕獲步驟然后一個或多個陽離子交換結(jié)合/洗脫色譜步驟和陰離子交 換色譜步驟。
[0005] CH0細胞常用于單克隆抗體的制備。典型的CH0細胞培養(yǎng)進料包含1〇3-1〇9病毒 或病毒樣顆粒，并且在純化過程中去除運類病毒或病毒樣顆粒特別重要，因為許多祀蛋白 是直接給藥于患者的治療性蛋白。一般來說，基于整個純化過程達到的總病毒去除的量評 價病毒去除，期望其等于或超過18個對數(shù)（log)，特別是在需要監(jiān)管機構(gòu)批準的情況下。
[0006] -般來說，據(jù)顯示典型純化過程的每個步驟去除一定量的病毒；但是，所述量通常 少于18個對數(shù)；因此，過程中必須包括額外的純化步驟用于足夠的病毒去除。建立特定純 化步驟是否可W去除一定量的病毒非常重要，W便確保通過純化過程中的各種純化步驟達 到足夠的病毒去除。
[0007] 樣品如生物技術(shù)產(chǎn)物的病毒安全評價的指導可W在InternationalConference onHarmonizationofTechnicalRequirementsfor民egistrationofPharmaceuticals forHumanUse(ICH)主持下編寫的"HarmonizedTripartate加ideline:Q5AViral SafetyofBiotechnologyProductsDerivedFromCellLinesofHumanorAnimal Origin.Fed.Reg. 63 (18巧 24September1998"中找到。
[0008] 活性炭W前已用于水純化應用W去除病毒^及并入過濾單元用于從生物流體如 血液非特異性地去除物質(zhì)，所述物質(zhì)可W包括病毒（例如，參見，美國專利第8, 123, 940 號）。
[0009] 此外，整體援引加入本文的2012年8月2日提交的美國專利申請系列號 13/565, 463描述了活性炭聯(lián)合其他介質(zhì)在從包含所關(guān)注的生物分子（例如，抗體）的樣品 去除蛋白雜質(zhì)（例如，宿主細胞蛋白）和DNA中的用途。
[0010] 最后，援引加入本文的2013年2月26日提交的美國臨時專利申請系列號 61/769, 269描述了活性炭在通過改變?nèi)芤簵l件來從蛋白混合物選擇性地去除蛋白中的用 途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明至少部分是基于令人驚訝和出乎意料的發(fā)現(xiàn)，在包含祀蛋白如單克隆抗體 的某些樣品的情況下，活性炭可W用于減少病毒的量。雖然，W前已描述活性炭在水純化 中去除一些病毒，但是用活性炭處理的樣品一般具有低濃度的蛋白或無蛋白。本發(fā)明至少 部分是基于出乎意料和令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，在包括高蛋白濃度的某些樣品（例如，包含待分 離的祀蛋白的細胞培養(yǎng)進料或細胞裂解物）中，活性炭特異性地結(jié)合病毒，包括細小病毒、 逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒。因此，在某些純化方法中包括活性炭可W導致可能消除 蛋白純化中通常使用的一個或多個昂貴的色譜步驟（例如，陽離子交換結(jié)合/洗脫色譜步 驟）。
[0012] 在各種實施方案中，提供一種確定活性炭是否可W用于從包含祀蛋白的樣品去 除病毒的方法，其中所述方法包括W下步驟：(a)提供包含祀蛋白的一部分樣品；化）W 104-10中即/mL的量將病毒添加至所述一部分樣品中；化）使所述一部分樣品流過裝有活性 炭的柱；（C)從所述柱收集包含所述祀蛋白的一個或多個部分；W及（d)測量所述一個或多 個部分中的病毒量，其中一個或多個部分中的病毒量減少至少3.化RV表明活性炭能夠用 于從所述樣品去除病毒。
[0013] 在一些實施方案中，所述樣品包含等于或大于0.2g/L的蛋白濃度。在一些實施方 案中，所述樣品包含3. 0-10. 0范圍中的抑和/或少于0. 5M的鹽濃度。
[0014] 在一些實施方案中，所述樣品包含細胞培養(yǎng)進料。在一具體實施方案中，所述細胞 培養(yǎng)進料為CH0細胞培養(yǎng)進料。
[0015] 在一些實施方案中，所述樣品包含已進行澄清的細胞培養(yǎng)進料。澄清方法包括但 不限于離屯、、沉降、深層過濾、篩過濾、絮凝、使用刺激響應性聚合物和抑改變。
[0016] 在一些實施方案中，所述樣品包含洗脫液，所述洗脫液回收自祀蛋白的純化中使 用的A蛋白色譜步驟。
[0017] 在一些實施方案，所述樣品包含細胞裂解物，所述細胞裂解物獲得自細胞內(nèi)表達 祀蛋白的細胞。
[0018] 在一些實施方案中，所述祀蛋白為重組蛋白。示例性祀蛋白包括但不限于免疫球 蛋白如單克隆抗體、包含F(xiàn)c的蛋白W及非免疫球蛋白。
[0019] 在一具體實施方案中，所述祀蛋白為治療性蛋白。
【附圖說明】
[0020] 圖1為示出實驗結(jié)果的圖，如對4種不同類型的單克隆抗體樣品觀察的，W便確 定通過使溶液流過活性炭柱是否可W從單克隆抗體溶液去除小鼠細小病毒（MVM)代表的 細小病毒。對于兩種不同的單克隆抗體溶液ΜΑΒΙ和MABIV，在1.Okg/L和2.Okg/L的柱裝 載，W大于5.化RV的量去除MVM。但是，對于另外兩種單克隆抗體溶液MBII和MBIII，在 0. 5kg/L、l.Okg/L和2.Okg/L的柱裝載，未W1.化RVW上的量去除MVM。X-軸示出在采集 部分的點裝載至每升（L)活性炭柱上的單克隆抗體的量（Wkg計），而Y-軸示出部分中 MVM病毒的對數(shù)減少值。向上箭頭表示樣品中病毒的濃度低于部分的檢測限。
[0021] 圖2為示出實驗結(jié)果的圖，如對4種不同類型的單克隆抗體樣品觀察的，W便確定 通過流過活性炭柱是否可W從單克隆抗體溶液去除異嗜性小鼠白血病病毒狂MuLV)代表 的逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。對于ΜΑΒΙ抗體溶液，在0.化g/l、1.Okg/L和1.化g/L的 柱裝載，W大于3. 0LRV的量去除XMuLV。在抗體溶液和MBIV的情況下，在 0. 2kg/L、0. 5kg/L和1.Okg/L的柱裝載，W大于5.化RV的量去除XMuLV。X-軸示出在采集 部分的點裝載至每升（L)活性炭柱上的單克隆抗體的量（Wkg計），而Y-軸示出部分中 XMuLV病毒的對數(shù)減少值。向上箭頭表示樣品中病毒的濃度低于部分的檢測限。
【具體實施方式】
[0022] 如上文討論的，本發(fā)明至少部分是基于新的和出乎意料的發(fā)現(xiàn)，活性炭可W用于 從包含待純化的祀蛋白的某些高蛋白濃度樣品如某些細胞培養(yǎng)進料或細胞裂解物去除病 〇
[0023] 在包含治療性蛋白的生物反應器進料中病毒的典型濃度一般非常低。但是，運些 低水平對于用純化的治療性蛋白治療的患者仍然可能非常危險。為了確保在蛋白純化中充 分去除蛋白，確定某個純化步驟是否從包含待純化的蛋白的樣品去除樣品還有確定運個純 化步驟去除的病毒的量非常重要。
[0024] 為了運樣做，W已知濃度將代表性病毒滲入包含治療性蛋白的溶液，然后使?jié)B入 病毒的治療性蛋白溶液進行某個純化步驟。純化步驟之后，確定溶液中代表性病毒的量。在 純化步驟之后的溶液中病毒的水平低于該病毒的檢測限或者不可檢測表示通過純化步驟 充分去除病毒。細小病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒是一般在純化CK)細胞中表達的治療性蛋白期間測 量的兩種類型的病毒。
[00巧]通常，用來確定純化步驟中從包含蛋白的樣品去除的病毒量的方法采用一部分樣 品代替整個樣品體積。一旦確定特定純化步驟能夠從一部分包含祀蛋白的樣品去除病毒， 則可W認為所述純化步驟會從所述樣品去除病毒，只要采用的純化介質(zhì)和祀蛋白的比例保 持相同。
[0026] 本發(fā)明提供確定活性炭是否可W用于從某些樣品去除某些病毒的方法。如本文實 施例中證實的，利用本文所述的方法，可W確定活性炭是否能夠從包含祀蛋白的特定樣品 去除病毒。因此，對于其中活性炭能夠去除病毒的包含祀蛋白的那些樣品，隨后可W將活性 炭并入該樣品的純化方法。
[0027] 為了可W更容易地理解本公開，首先定義某些術(shù)語。額外的定義在整個詳細說明 書中示出。
[0028] I.定女
[0029] 在本文中可交換使用的術(shù)語"活性炭（activecarbon)"或"活性炭（activated carbon)"指已進行增加其孔結(jié)構(gòu)的處理的含碳物質(zhì)。活性炭有時還稱作活性木炭?；钚蕴?是具有非常高表面積的多孔固體。它們可W源自各種來源，包括煤炭、木材、挪殼、果殼和泥 炭?？蒞利用在受控氣氛下物理活化（包括加熱）或者利用強酸、堿或氧化劑化學活化來 從運些材料制備活性炭?；罨^程產(chǎn)生具有高表面積的多孔結(jié)構(gòu)，運賦予活性炭高的雜質(zhì) 去除能力?？蒞修改活化過程W控制表面的酸性。
[0030] 典型的活化過程包括使碳源如樹脂廢物、煤炭、煤焦、石油焦、褐煤、聚合材料、W 及包括紙漿和紙的木質(zhì)纖維素材料、來自紙漿生產(chǎn)的殘余物、木材（如木屑、銀末和木粉）、 堅果殼（如杏仁殼和挪子殼）、果仁w及果核（如橄攬核和樓桃核）進行熱過程（例如，用 氧化性氣體）或化學過程（例如，用憐酸或金屬鹽，如氯化鋒）。包括用憐酸（H3P04)化學 活化基于木材的碳的示例性過程公開于美國專利第Re. 31，093號，其導致碳的脫色和氣體 吸附能力的提高。而且，美國專利第5, 162, 286號教導了基于木材的材料的憐酸活化，所述 基于木材的材料特別致密且包含相對高（30%)的木質(zhì)素含量，如堅果殼、果核和果仁。木 質(zhì)纖維素材料的憐酸活化還在美國專利第5, 204, 310號中討論，作為制備高活性和高密度 的碳的一個步驟。運段中列出的每個專利的教導整體援引加入本文。
[0031] 與大多數(shù)其他吸附材料相反，據(jù)信活性炭利用相對弱的范德華力或倫敦分散力與 分子相互作用。如通過基于氮吸附的化unauer-Emmett-Teller("邸T")方法（本領(lǐng)域公 知的方法）測量的，典型的商業(yè)活性炭產(chǎn)品表現(xiàn)出至少300m7g的表面積。
[0032] 雖然，活性炭（activecarbon或activatedcarbon)W前已用于純化液體和氣體 W及通過結(jié)合雜質(zhì)來從其他雜質(zhì)純化重組表達的抗體的方法，但是其W前尚未用于從高蛋 白濃度樣品（即〉〇.2g/L蛋白濃度）去除病毒，特別是細小病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。因此，在某 些情況下，對于在純化治療性蛋白如單克隆抗體的過程中去除病毒，活性炭提供成本上有 效的方案。
[0033] 本發(fā)明提供確定活性炭是否可W用于從包含祀蛋白的樣品去除病毒的方法?；?本文提供的方法，因為活性炭并不在所有樣品的情況下導致有效去除病毒，所W可W容易 地確定在哪些樣品的情況下，活性炭可W用于去除病毒或特定類型的病毒。
[0034] 在本文中可交換使用的術(shù)語"所關(guān)注的蛋白"和"祀蛋白"指蛋白或多膚，其純化 自包含病毒的組合物。在一些實施方案中，祀蛋白是向患者給藥的治療性蛋白。
[0035] 一般來說，作為病毒去除的結(jié)果，祀蛋白的總純度增加。祀蛋白可W是免疫球蛋白 或非免疫球蛋白，并且可W是分泌性蛋白或細胞內(nèi)蛋白。在一些實施方案中，祀蛋白為免疫 球蛋白，例如單克隆抗體。
[0036] 祀蛋白的其他實例包括重組蛋白，其包括但不限于重組人生長激素、重