癌癥中靶向cd138的制作方法
【專利說明】癌癥中祀向CD138
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本發(fā)明要求2013年3月7日提交的美國臨時專利申請系列第61/774,040號的優(yōu) 先權(quán)，其通過引用全文納入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明的實施方式至少設(shè)及細胞治療、免疫學(xué)、免疫治療、分子生物學(xué)、細胞生物 學(xué)和醫(yī)學(xué)，包括癌癥醫(yī)學(xué)的領(lǐng)域。
[0004] 背景
[0005] 在過去的15年，使用高劑量化療和干細胞捶救、沙利度胺、來那度胺 (lenalidomide)和棚替佐米化ortezomib)已經(jīng)延長了多發(fā)性骨髓瘤（MM)患者的存活（10 年存活大約為30%)。然而，該疾病仍然基本無法治愈。惡性漿細胞（PC)對于T-細胞免 疫識別和消除敏感，如由用骨髓消融性或非骨髓消融性同種異體干細胞移植治療的患者中 移植物對抗MM的作用所介導(dǎo)的腫瘤消退所示。運一觀察已經(jīng)刺激了開發(fā)基于運種設(shè)及在 腫瘤PC中過表達的幾種可祀向腫瘤相關(guān)抗原（TAA)的疾病中腫瘤特異性細胞毒性T淋己 細胞（CTL)的離體生成的過繼T-細胞療法。
[0006] 在過去的幾年中，血液惡性腫瘤中的嵌合抗原受體（CAR)技術(shù)呈指數(shù)增長。CAR 是人工受體，其由從特異性單克隆抗體獲得的單鏈可變片段（scFv)(抗原-結(jié)合位點）組 成，連接到CD3C鏈的胞漿內(nèi)結(jié)構(gòu)域和共刺激內(nèi)結(jié)構(gòu)域。當(dāng)由T細胞表達時，CAR同時介導(dǎo) MHC-無限制抗原識別和T-細胞共刺激。
[0007] 為了使用CAR技術(shù)祀向惡性PC，選擇在惡性PC的細胞表面上總是過表達的CD138 分子（多配體聚糖-1)。運種祀向抗原已經(jīng)通過開發(fā)CD138-特異性人源化單克隆抗體的 成功努力對匪驗證，其已經(jīng)在臨床試驗中產(chǎn)生了理想的初步報告。通過使用CAR技術(shù)將 CD138-抗體特異性與T淋己細胞的細胞毒性和壽命結(jié)合應(yīng)代表了顯著的治療進展。
[0008] 雖然CD138在生理上位于簡單上皮細胞的基底外側(cè)表面上并且圍繞分層上皮細 胞，向MM患者給予CD138-單克隆抗體具有證明的安全性，可能是由于在運些正常組織上的 CD138表達密度低。然而，CD138-抗體作為CAR在T細胞上的表達可能增加了抗體的親合 力并帶來其它T-細胞效應(yīng)機制，從而導(dǎo)致已經(jīng)在其它CAR中觀察到的"命中祀標(biāo)"但"脫離 器官"的細胞毒性祀向在正常組織中低水平表達的抗原。如果通過激活充足的自殺基因來 快速消除CAR-T細胞，則可避免運種不希望的作用，或者如果CAR僅由T細胞瞬時表達（例 如在mRNA轉(zhuǎn)染之后），則降低運種不希望的作用。然而，即使兩種方法增加了安全性，它們 消除了過繼T細胞療法的主要優(yōu)勢，即對疾病的長期免疫控制。
[0009] 本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域中對患有CD138-表達癌癥（至少包括MM)的個體提供有效 過繼T-細胞療法的需求。
[0010] 概述
[0011] 本發(fā)明設(shè)及與細胞療法相關(guān)的方法和組合物。在具體的實施方式中，細胞療法用 于對細胞療法有需求的個體，如哺乳動物，包括人。細胞療法可適用于任何醫(yī)學(xué)條件，雖然 在【具體實施方式】中，該細胞療法是用于腫瘤。癌癥可w是任意類型和任意階段。個體可w是任意年齡或性別。在【具體實施方式】中，個體已知患有癌癥、處于患有癌癥的風(fēng)險中、或者 易于患有癌癥。癌癥可W是原發(fā)性癌癥或轉(zhuǎn)移性癌癥，并且癌癥可能難W治療。個體可具 有癌癥復(fù)發(fā)。在【具體實施方式】中，癌癥是血液惡性腫瘤，如B系血液惡性腫瘤。在一些情況 中，癌癥不是血液惡性腫瘤。在一些情況中，血液是骨髓瘤，包括多發(fā)性骨髓瘤。在具體實施 方式中，癌癥是例如，白血病、淋己瘤、骨髓瘤、乳腺癌、肺癌、腦癌、結(jié)腸癌、腎癌、前列腺癌、 膜腺癌、甲狀腺癌、骨癌、宮頸癌、脾癌、肛口癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽囊癌、黑色素瘤、非 小細胞肺癌等。在具體方面中，癌癥表達一種或多種腫瘤抗原，并且在【具體實施方式】中，細 胞療法祀向運一種或多種腫瘤抗原。在【具體實施方式】中，腫瘤抗原是CD138 (其也可稱為多 配體聚糖-1)。
[0012] 在本發(fā)明的【具體實施方式】中，存在設(shè)及適用于免疫療法的細胞的方案和組合物。 在特定方面中，本發(fā)明的方法和組合物是對本領(lǐng)域中采用的技術(shù)的改進。在具體情況中，本 發(fā)明的實施方式是對任意類型的免疫療法所采用的細胞的改進，雖然在特定情況中，免疫 治療細胞用于癌癥療法。
[0013]在本發(fā)明的特定方面中，向個體提供細胞，該細胞向個體提供治療。細胞可W是任 何類型，但在【具體實施方式】中，該細胞能夠向具有表達CD138抗原的癌細胞的個體提供治 療。在某些實施方式中，向已知患有表達CD138的癌癥的個體提供細胞，如B系血液惡性 腫瘤，如多發(fā)性骨髓瘤，雖然在某些情況中，沒有確定CD138抗原的存在。該細胞可W是免 疫細胞，如T-細胞。在一些情況中，該細胞可W是細胞毒性T淋己細胞（CTL)、NK-細胞、 NKT-細胞等。
[0014]在本發(fā)明的實施方式中，存在與治療載體和/或含有該載體的細胞相關(guān)的方法和 組合物。在本發(fā)明的方面中，本發(fā)明的治療細胞祀向包含CD138抗原的癌細胞，但是不祀 向具有CD138抗原的其它細胞，并且運種差別是治療細胞中CD138受體的環(huán)境特異性表達 的結(jié)果。在【具體實施方式】中，本發(fā)明的方法和組合物設(shè)及具有CD138-特異性嵌合抗原受 體的細胞，其表達處于環(huán)境特異性調(diào)控的控制之下。在【具體實施方式】中，環(huán)境是低氧。在 某些實施方式中，本發(fā)明的方法和組合物設(shè)及具有表達處于組織特異性調(diào)控的控制之下的 CD138-特異性嵌合抗原受體的細胞。在一些情況中，除了或替代環(huán)境調(diào)控和/或組織特異 性調(diào)控，材料包含自殺基因。
[0015]在本發(fā)明的某些方面中，任何CAR(包括除了CD138W外）在低氧特異性調(diào)控下在 本發(fā)明中采用。示例性CAR是CD138的替代或除了CD138W外包含對選自下組的抗原的特 異性：黑色素瘤-相關(guān)抗原（MAGE)，黑色素瘤的優(yōu)先表達抗原（PRAME)、生存素、CD19XD20、 CD22、k輕鏈、CD30、CD33、CD123、CD38、R0R1、ErbB2、ErbB3/4、ErbB二聚體、EGFrVIII、癌 胚抗原、EGP2、EGP40、間皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配體、B7-冊、比-13 受體a2、MUCl、MUC16、 CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、LewisY、G250/CAIX、HLA-AIMAGEA1、HLA-A2NY-ES0-1、 PSCA、葉酸受體-a、CD44v6、CD44v7/8、aybe整聯(lián)蛋白、8H9、NCAM、VEGF受體、5T4、胎牛AchR、 NKG2D配體、CD44v6、雙抗原和通用抗原。
[0016]在本發(fā)明的某些方面中，在腫瘤環(huán)境中存在免疫細胞，如Τ-細胞，其表達CAR.CD138,而非組成型表達。已經(jīng)通過受影響部位中氧壓的直接測量（22)和HIF-la(低氧誘 導(dǎo)應(yīng)答的主要調(diào)節(jié)物）過表達（23, 24)間接證明低含氧量MM微環(huán)境?？赏ㄟ^用低氧相應(yīng) 元件控制其表達來調(diào)節(jié)τ細胞中CAR.CD138的表達，使得工程改造的Τ細胞僅在低氧MM微 環(huán)境內(nèi)表達功能水平的CAR,從而限制抗原祀向其它器官中。
[0017] 在本發(fā)明的一些實施方式中，存在編碼CD138-特異性嵌合抗原受體（CAR)和與之 功能上相關(guān)的一種或多種低氧應(yīng)答調(diào)控元件的表達載體。在【具體實施方式】中，該載體還包 含編碼誘導(dǎo)型自殺基因的序列。
[0018] 在一個實施方式中，存在編碼CD138-特異性嵌合抗原受體（CAR)并包含W下的 表達載體：a) -種或多種低氧應(yīng)答調(diào)控元件，其在功能上與CD138-特異性CAR相關(guān)；和/ 或b)誘導(dǎo)型自殺基因（例如，脫冬酶9、單純瘤疹病毒、胸巧激酶化SV-tk)、胞喀晚脫氨酶 (CD)和細胞色素P450)。在【具體實施方式】中，載體是非病毒載體或病毒載體（如逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體、慢病毒載體、腺病毒載體或腺相關(guān)病毒載體）。在【具體實施方式】中，CD138-特異性CAR 包含IgGl較鏈區(qū)。在至少一些情況中，CD138-特異性CAR包含胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，該結(jié) 構(gòu)域選自下組：CD28、0X40、4-1BB、IC0S及其組合。CD138-特異性CAR可包含選自CD3-C 和CD28的跨膜結(jié)構(gòu)域。
[0019] 低氧應(yīng)答調(diào)控元件可包含VEGF低氧應(yīng)答調(diào)控元件、α1B-腎上腺素能受體低氧應(yīng) 答調(diào)控元件、脂肪酸合成酶低氧應(yīng)答調(diào)控元件或其組合。
[0020] 在本發(fā)明的實施方式中，存在包含本發(fā)明的載體的細胞。該細胞是真核細胞，包括 人細胞。該細胞可相對于特定個體是自體同源的、同系的、同種異體的或異種異體的。在一 些情況中，提供本發(fā)明的方法和/或組合物的個體需要癌癥治療，包括針對特定類型的癌 癥。在一些情況中，個體需要針對Β系血液惡性腫瘤的治療。在特定情況中，個體需要針對 CD138-表達癌癥，包括至少多發(fā)性淋己瘤的治療。該細胞可W是任意類型，但在具體實施方 式中，該細胞是免疫細胞，如Τ-細胞。該細胞可W是例如細胞毒性Τ淋己細胞（CTL)、自然 殺傷細胞、或自然殺傷Τ細胞。該細胞可W是效應(yīng)細胞。該細胞可W是病毒特異性的Τ細 胞，并且該病毒可W是例如，邸V、CMV、腺病毒、ΒΚ病毒、HHV6、RSV、流感病毒、副流感病毒、 博卡病毒、冠狀病毒、LCMV、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、偏肺病毒、細小病毒Β、輪狀病毒、 西尼羅河病毒、JC、HHV7或HIV。
[0021] 在一些情況中，該細胞包含針對除CD138W外的抗原或作為CD138的替代物的 抗原有特異性的至少一種其它CAR。在本發(fā)明的【具體實施方式】中，CAR針對選自下組的抗 原具有特異性：黑色素瘤-相關(guān)抗原（MAGE)，黑色素瘤的優(yōu)先表達抗原（PRAME)、生存素、 CD19、CD20、CD22、k輕鏈、CD30、CD33、CD123、CD38、R0R1、ErbB2、ErbB3/4、ErbB二聚體、 EGFrVIII、癌胚抗原、EGP2、EGP40、間皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配體、B7-冊、比-13 受體 a2、MUC1、MUC16、CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、LewisY、G250/CAIX、HLA-AIMAGEA1、 HLA-A2NY-ES0-1、PSCA、葉酸受體-a、CD44v6、CD44v7/8、aybe整聯(lián)蛋白、8H9、NCAM、VEGF受 體、5T4、胎牛AchR、NKG2D配體、CD44v6、雙抗原和通用抗原。
[0022] 在除了使用CD138-特異性CAR或替代的實施方式中，本發(fā)明的細胞表達指向 CD138的可分泌接合蛋白，所述蛋白包含激活結(jié)構(gòu)域和抗原識別結(jié)構(gòu)域。激活結(jié)構(gòu)域、抗原 識別結(jié)構(gòu)域或兩種結(jié)構(gòu)域可包含單鏈可變區(qū)片段（scFv)抗體部分，并且該激活結(jié)構(gòu)域可 包含識別選自下組的分子的scFv:CD3、CD16、CD28、CD40、CD134和CD137。在特定實施方 式中，與CAR聯(lián)用時，可存在編碼與PD-1、CTLA-4、LAG-3、Tim-3等（結(jié)合或抑制基序）組 合的CD138-結(jié)合基序的接合物。在某些實施方式中，抗原識別結(jié)構(gòu)域結(jié)合CD138,但是其可 結(jié)合黑色素瘤-相關(guān)抗原（MAGE),黑色素瘤的優(yōu)先表達抗原（PRAME)、生存素、CD19、CD20、CD22、k輕鏈、CD30、CD33、CD123、CD38、R0R1、ErbB2、ErbB3/4、ErbB二聚體、EGFrVIII、癌 胚抗原、EGP2、EGP40、間皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配體、B7-冊、比-13 受體a2、MUCl、MUC16、 CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、LewisY、G250/CAIX、HLA-AIMAGEA1、HLA-A2NY-ES0-1、 PSCA、葉酸受體-a、CD44v6、CD44v7/8、aybe整聯(lián)蛋白、8H9、NCAM、VEGF受體、5T4、胎牛AchR、 NKG2D配體、CD44v6、雙抗原或通用腫瘤抗原。
[0023] 在本發(fā)明的實施方式中，提供了一種治療個體癌癥的方法，包括向個體遞送治療 有效量的本發(fā)明的載體的步驟。在某些實施方式中，存在治療個體中癌癥的方法，包括向該 個體遞送治療有效量的本發(fā)明的細胞的步驟。
[0024] 在本發(fā)明的一些實施方式中，存在編碼腫瘤抗原特異性CAR和與之功能上相關(guān)的 一種或多種低氧應(yīng)答調(diào)控元件的表達載體。該載體還可包含編碼誘導(dǎo)型自殺基因的序列。 在本發(fā)明的實施方式中，存在編碼腫瘤抗原特異性CAR的表達載體，該表達載體包含：a)與 腫瘤抗原特異性CAR功能上相關(guān)的一種或多種低氧應(yīng)答調(diào)控元件；和/或b)誘導(dǎo)型自殺 基因。本發(fā)明的任意載體可包含CAR,其具有針對選自下組的腫瘤抗原的特異性：黑色素 瘤-相關(guān)抗原（MAGE)，黑色素瘤的優(yōu)先表達抗原（PRAME)、生存素、CD19、CD20、CD22、k輕 鏈、CD30、CD33、CD123、CD38、R0R1、化bB2、化bB3/4、化bB二聚體、EGFr VIII、癌胚抗原、 EGP2、EGP40、間皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配體、B7-冊、比-13受體曰2、MUC1、MUC16、CA9、 GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、Lewis Y、G250/CAIX、HLA-AI MAGE AUHLA-A2NY-ES0-UPSCA、 葉酸受體-曰、〔044￥6、〔044￥7/8、曰、66整聯(lián)蛋白、8冊、肥41、￥66尸受體、5了4、胎牛4油1?、服620 配體、CD44V6、雙抗原和通用抗原。用運些載體治療癌癥的方法包含于本發(fā)明。表達運些載 體的細胞和使用細胞治療癌癥的方法也包含于本發(fā)明。
[0025] 在本發(fā)明的實施方式中，存在包含本文所述的載體和/或本文所述細胞的試劑 盒。
[0026] 在本發(fā)明的實施方式中，存在編碼至少一個CD138-特異性識別部分并具有與之 功能上相關(guān)的一個或多個低氧應(yīng)答調(diào)控元件的多核巧酸。在【具體實施方式】中，CD138-特異 性識別部分包含CD138-特異性嵌合抗原受體（CAR)、CD138-特異性接合分子或同時包含 兩者。在【具體實施方式】中，該多核巧酸還定義為表達載體。在某些實施方式中，該多核巧 酸還包含編碼誘導(dǎo)型自殺基因的序列。在一些情況中，載體是非病毒載體或病毒載體（包 括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或腺相關(guān)病毒載體）。在某些實施方式中， CD138-特異性CAR包含IgGl較鏈區(qū)。在一些情況中，CD138-特異性CAR包含胞內(nèi)信號傳 導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域選自下組：CD28、0X40、4-1BB、IC0S及其組合。在特定情況中，CD138-特 異性CAR包含選自CD3-C和CD28的跨膜結(jié)構(gòu)域。在特定方面，自殺基因選自下組：脫冬酶 9、單純瘤疹病毒、胸巧激酶化SV-tk)、胞喀晚脫氨酶（CD)和細胞色素P450。在一些實施方 式中，低氧應(yīng)答調(diào)控元件包含VEGF低氧應(yīng)答調(diào)控元件、α1B-腎上腺素能受體低氧應(yīng)答調(diào) 控元件、脂肪酸合成酶低氧應(yīng)答調(diào)控元件或其組合。
[0027] 在一些實施方式中，提供了一種包含本發(fā)明的多核巧酸的細胞。在【具體實施方式】 中，該細胞是真核細胞，如人細胞，包括免疫細胞。在特定實施方式中，細胞還限定為相對 于特定個體是自體同源的、同系的、同種異體的或異種異體的。該個體可能需要癌癥治療， 包括對Β-系血液惡性腫瘤如多發(fā)性骨髓瘤的治療。在一些情況中，該細胞還可限定為細 胞毒性Τ淋己細胞（CTL)、自然殺傷細胞或自然殺傷Τ細胞。該細胞可包含對病毒潛伏蛋 白有特異性的天然受體。示例性的病毒包括EBV、CMV、腺病毒、ΒΚ病毒、HHV6、RSV、流感病 毒、副流感病毒、博卡病毒、冠狀病毒、LCMV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、偏肺病毒、細小病毒Β、 輪狀病毒、西尼羅河病毒、JC、HHV7或HIV。在特定實施方式中，該細胞包含對除CD138W 外的抗原有特異性的至少一種其它CAR。該CAR可針對選自下組的抗原有特異性：黑色素 瘤-相關(guān)抗原（MAGE)，黑色素瘤的優(yōu)先表達抗原（PRAME)、生存素、CD19、CD20、CD22、k輕 鏈、CD30、CD33、CD123、CD38、R0R1、化bB2、化bB3/4、化bB二聚體、EGFrVIII、癌胚抗原、 EGP2、EGP40、間皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配體、B7-冊、比-13 受體a2、MUCl、MUC16、CA9、GD2、 GD3、HMW-MAA、CD171、LewisY、G250/CAIX、HLA-AIMAGEA1、HLA-A2NY-ES0-1、PSCA、葉酸 受體-a、CD44v6、CD44v7/8、曰九整聯(lián)蛋白、8H9、NCAM、VEGF受體、5T4、胎牛AchR、NKG2D配 體、CD44v6、雙抗原和通用抗原。在特定實施方式中，CD138-特異性識別部分包含CD138-特 異性接合分子，其具有激活結(jié)構(gòu)域和抗原識別結(jié)構(gòu)域，其中兩種結(jié)構(gòu)域包含單鏈可變區(qū)片 段（scFv)抗體部分。在一些情況中，激活部分是識別選自下組的分子的scFV:CD3、CD16、 〔028、〔040、〔01：34和〔0137。
[0028] 在一個實施方式中，存在治療個體中癌癥的方法，包括向該個體遞送治療有效量 的本發(fā)明的多核巧酸的步驟。在一些實施方式中，存在治療個體中癌癥的方法，包括向該 個體遞送治療有效量的本發(fā)明的細胞的步驟。在特定實施方式中，存在包含本發(fā)明的載體 的試劑盒。在【具體實施方式】中，存在包含本發(fā)明的一種或多種細胞的試劑盒。在一些方 面，存在編碼腫瘤抗原特異性CAR和與之功能上相關(guān)的一種或多種低氧應(yīng)答調(diào)控元件的表 達載體。在某些實施方式中，該載體還包含編碼誘導(dǎo)型自殺基因的序列。該載體可包含選 自下組的腫瘤抗原：黑色素瘤-相關(guān)抗原（MAGE)，黑色素瘤的優(yōu)先表達抗原（PRAME)、生存 素、CD19、CD20、CD22、k輕鏈、CD30、CD33、CD123、CD38、R0R1、ErbB2、ErbB3/4、ErbB二聚 體、EGFrvIII、癌胚抗原、EGP2、EGP40、間皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配體、B7-冊、比-13 受 體a2、MUCl、MUC16、CA9、GD2、GD3、HMW-MM、CD171、LewisY、G250/CAIX、HLA-AIMAGEA1、 HLA-A2NY-ES0-1、PSCA、葉酸受體-a、CD44v6、CD44v7/8、aybe整聯(lián)蛋白、8H9、NCAM、VEGF受 體、5T4、胎牛AchR、NKG2D配體、CD44v6、雙抗原和/或通用抗原。
[0029] 前述內(nèi)容相當(dāng)寬泛地描述了本
【發(fā)明內(nèi)容】
的特征和技術(shù)優(yōu)點，使得能夠更好地理解 W下的詳細說明。W下描述的本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點構(gòu)成本發(fā)明要求保護的主題。本領(lǐng) 域的技術(shù)人員應(yīng)理解，所掲示的觀念和【具體實施方式】可W方便地被用作改進或設(shè)計實現(xiàn)本 發(fā)明的同樣目的的其他結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)認(rèn)識到運種等價結(jié)構(gòu)沒有偏離 所附權(quán)利要求書中提出的本發(fā)明的精神和范圍。被認(rèn)為是本發(fā)明的特征的新特征，對于其 構(gòu)建和方法的操作，還有其他對象和優(yōu)點等，可W結(jié)合W下詳細的說明和附圖一起，得到更 好的理解。但應(yīng)理解，各附圖僅僅是為了示意和說明，并不旨在對本發(fā)明進行限定。
[0030] 附圖簡要說明
[0031] 為了更完整地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖提供W下說明，其中：
[0032] 圖1.CAR.CD138的生成和表征。組圖A.在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中編碼的CAR.CD138的 示意圖。組圖B.逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后，CAR在激活的CD4+和CD8巧細胞中高效表達。組圖C 顯示了用標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放試驗評價的對照和CAR.CD138T針對CD138+祀標(biāo)（RPMI和U266)、 CD138-祀標(biāo)（拉吉）和NK祀標(biāo)化562)的細胞毒活性。數(shù)據(jù)表示4個不同供體的平均 值±SD。組圖D.用CD138+祀標(biāo)扣266和RPMI)或CD138-祀標(biāo)（拉吉）共培養(yǎng)的對照和CAR巧細胞燈細胞：腫瘤細胞的比率為5:1)。在培養(yǎng)4天后，收集細胞并用CD3和CD138 染色W評價腫瘤細胞的生長。當(dāng)其與CAR巧細胞共培養(yǎng)時，沒有可檢測的腫瘤細胞。數(shù)據(jù) 表示4個不同供體的平均值+SD。組圖E顯示了使用含有來自2個供體的CD138+惡性PC 的BM樣品的共培養(yǎng)實驗。CAR巧細胞而不是對照細胞消除了惡性PC。組圖F顯示了響應(yīng) CD138+祀標(biāo)U266細胞的T細胞的Thl概況。
[0033] 圖2a和化.CAR.CD138巧淋己細胞具有體內(nèi)抗-MM作用。在含有用FFLuc標(biāo)記的 U266細胞的SCID小鼠中靜脈輸注對照和CAR.CD138+T細胞。不使用外源性細胞因子。使 用體內(nèi)成像系統(tǒng)狂enogen-IVIS成像系統(tǒng)）來監(jiān)測腫瘤生長。左圖顯示了在接受對照的小 鼠中測量為信號強度（p/s/cm2/sr)的腫瘤生長明顯高于接受CAR.CD138+T細胞的小鼠。右 圖顯示了兩個不同實驗中每組5只小鼠的平均值+SD。
[0034] 圖3.hCAR.CD138的生成和表征。組圖A.在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中編碼的hCAR.CD138 的示意圖。組圖B.持續(xù)48小時低氧中的T細胞中組成型CAR.CD138和hCAR.CD138的表達 與正常氧壓中的相比。組圖C.對照、CAR.CD138+和hCAR.CD138巧細胞在低氧中與CD138+ 祀標(biāo)扣266)共培養(yǎng)燈細胞：腫瘤細胞的比率為2:1)。在培養(yǎng)3天后，收集細胞并用CD3 和CD138染色W評價腫瘤細胞的生長。當(dāng)運些細胞與表達組成型CAR.CD138或hCAR.CD138 的T細胞共培養(yǎng)時，沒有可檢測的腫瘤細胞。
[0035] 圖4.CAR.CD138可在來自健康供體和多發(fā)性骨髓瘤（MM)樣品的T細胞中高效和 穩(wěn)定地表達。（A)編碼包含CD28內(nèi)結(jié)構(gòu)域的CD138-特異性CAR的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。度） 在CD8+和CD4叮細胞上都檢測到CAR.CD138的表達。（C)在從健康供體生成的7個不同系 中CAR.CD138的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是74% ±9%，而在從匪患者生成的6個系中是82% ±5%。值） 來自健康供體的對照和轉(zhuǎn)導(dǎo)T細胞都含有均衡比例的CD3+CD8叮細胞（57% ±26%和54% ±14% )和CD3+CD4叮細胞（35% ±17%和37% ±13% )，而來自MM患者的T細胞更偏向 含有CD8+細胞（80% ±10%)。不到2%的細胞是CD3 -CD56+CD16+。來自健康供體和MM患 者的轉(zhuǎn)導(dǎo)T細胞也含有與離體增殖過程相容的一定比例的記憶和效應(yīng)記憶細胞仰45R0+: 分別為 82% ±16%和 79% ±9% ;CD62L+分別為 51 % ±