鑒定、分離并使用氣味和芳香受體的方法
【技術領域】
[0001] 本技術領域設及氣味（odorant)和芳香受體，W及可用于鑒定氣味和/或芳香化 合物的分析方法，并且更具體而言設及惡臭化合物如嗎I噪或糞臭素的抑制劑或沖消劑。
【背景技術】
[0002] 嗅覺是最復雜并且最少了解的人類感覺系統(tǒng)之一。從嗅覺受體（OR)的激活作用 到感知，仍有許多步驟需要進一步研究。如果我們能夠理解用于個體氣味和混合物的OR代 碼如何轉化為感知，那么我們就可W利用此知識為一些領域帶來顯著的利益。運些領域包 括：氣味調節(jié)劑，比如阻擋難聞氣味的感知的惡臭沖消劑；替代不可生物降解或有毒化合 物的新的調味料和芳香成分；和氣味增強劑，其將限制我們對于難W從天然來源探源化合 物的依賴性。"嗅覺代碼"的組合示例W如下觀察為中屯、：任何單一OR可由多種氣味激活， 并且相反，多數(shù)氣味能夠激活少數(shù)幾種OR。在小鼠基因組中，有大約1200種不同的OR。相 比之下，人類有大約400種。在運兩種情形中，OR的清單由世界上數(shù)千種氣味激活，而正是 運種組合的復雜性造成我們能感知的嗅覺感受的廣度。然而，自2010年W來，使用傳統(tǒng)的 脫孤法（deo巧hanization)只對于82種小鼠OR(約77% )和17種人類OR(約44% )鑒 定出氣味或配體。此外，大多數(shù)的人類OR配體（主要是試管內鑒定的）的生理相關性還未 經(jīng)測試。
[0003] 不同的OR脫孤法已見諸文獻[例如Touhara2007Deo巧hanizingvertebrate olfactoryreceptors:Recentadvancesinodorant-responseassaysNeurochem Int51, 132-139，W及Saitoetal(2009)OdorcodingbyaMammalianrec巧tor repertoire.SciSignal2,ra9,從及Peterlinetal. (2014),TheStateoftheArtof OdorantReceptorDeorphanization:aReportfromtheOrphanage,JGenPhysiol； 143巧）：527-42]。運些方法中的許多種都特定地依賴基于細胞的分析，其中OR在適合于高 通量篩選的非嗅覺細胞中表達。然而，OR通常保持在運樣的異源細胞的內質網(wǎng)中。因此， 如果不投放到細胞表面，運些OR就無法與氣味相互作用[Minetal. (2004化ndoplasmic reticulumdegradationimpedesolfactoryG-proteincoupledreceptorfunctional expression.BMCCellBiol5, 34]。因此，一種系統(tǒng)的方法--其中數(shù)百至數(shù)千種不同的 細胞系，其中各細胞系均具有可用于評估氣味活性的獨特的OR蛋白一一對于全面解碼氣味 與OR之間的組合相互作用來說是不適合的方法，因為許多或大多數(shù)受體在運樣的細胞系 中不能正常起作用。因此，需要新的方法，其能在生物體中存在的OR的完整列表中迅速且 可靠地鑒定出由一種或多種氣味特異性地激活或抑制的OR的相對較小的子集。進一步需 要一種方法，其設及從推定OR具有全部功能的嗅覺神經(jīng)元本身鑒定出0R，從而規(guī)避在非嗅 覺細胞中OR分析的公知挑戰(zhàn)。
[0004] 惡臭化合物如嗎I噪、糞臭素（3-甲基嗎I噪）和對甲酪產(chǎn)生難聞的氣味，其例如出 現(xiàn)于廁所和其他包含排泄物等的"浴室"來源。因此，掩蓋或減少例如人對運些化合物的嗅 覺的惡臭沖消劑是所希望的。需要鑒定出氣味受體，更特別而言惡臭受體。結合于嗎I噪和 糞臭素的受體也已鑒定出，結合于那些受體的化合物也已被發(fā)現(xiàn)并報告為惡臭的潛在調節(jié) 劑。然而，由于存在于哺乳動物的眾多0R，對于結合至惡臭受體，尤其是嗎I噪和糞臭素受體 的受體完整列表的快速鑒定仍然是所希望的。進一步希望依賴于新的惡臭受體W鑒定出結 合至運些受體的新的有效化合物的分析。

【發(fā)明內容】
陽〇化]本文提供一種鑒定被氣味或芳香化合物激活的嗅覺受體的方法，包括： 陽006] i)從非人類哺乳動物物種中將含有天然嗅覺神經(jīng)元的分離的嗅覺上皮解離成單 個細胞，其中每個神經(jīng)元都表達嗅覺受體；
[0007] j)給嗅覺細胞加載指示劑染料，該染料允許測定嗅覺受體的氣味或芳香受體結合 活性；
[0008] k)使嗅覺受體與各氣味或芳香化合物相繼接觸；
[0009] 1)測定由氣味或芳香誘導的神經(jīng)元活性的變化；
[0010] m)將被氣味或芳香化合物激活的一個或多個嗅覺神經(jīng)元分離；
[0011] η)擴增所分離的嗅覺受體的mRNA ;
[0012] 0)通過下一代測序技術對mRNA的轉錄組的至少一部分進行測序；并且
[0013]P)通過將該轉錄組的序列與同一物種和其他脊椎動物物種的參考基因組序列進 行比較，從而確定從由氣味和芳香受體組成的群組中選出的一組嗅覺受體的同一性。
[0014] 本文還提供一種鑒定被惡臭化合物激活的嗅覺受體的方法，包括： 陽015] a)從非人類哺乳動物物種中將含有天然嗅覺神經(jīng)元的分離的嗅覺上皮解離成單 個細胞，其中每個神經(jīng)元都表達嗅覺受體；
[0016] b)給嗅覺細胞加載指示劑染料，該染料允許測定嗅覺受體的惡臭受體結合活性；
[0017]C)使嗅覺受體與各惡臭化合物相繼接觸；
[0018] d)測定由氣味誘導的神經(jīng)元活性的變化；
[0019]e)將被惡臭化合物激活的一個或多個嗅覺神經(jīng)元分離；
[0020] f)擴增所分離的嗅覺受體的mRNA ;
[0021]g)通過下一代測序技術對mRNA的轉錄組的至少一部分進行測序；并且
[0022] h)通過將該轉錄組的序列與同一物種和其他脊椎動物物種的參考基因組序列進 行比較，從而確定一組惡臭嗅覺受體的同一性。 陽023] 本文還提供一種分離的核酸序列，其與從由如下序列構成的群組中選出的核酸序 列具有至少60%的序列同一性：SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQ IDN0:9、SEQIDN0:11、WQIDN0:13、WQIDN0:15、WQIDN0:27、WQIDN0:29、WQ IDN0:31、沈QIDN0:33、沈QIDN0:35、沈QIDN0:37、沈QIDN0:39、沈QIDN0:41、沈Q IDN0:43、沈QIDN0:45、沈QIDN0:47、沈QIDN0:49、沈QIDN0:51、沈QIDN0:53、沈Q IDN0:55、沈QIDN0:57、沈QIDN0:59、沈QIDN0:61、沈QIDN0:63、沈QIDN0:65、沈Q IDN0:67、沈QIDN0:69、沈QIDN0:71、沈QIDN0:73、沈QIDN0:75、沈QIDN0:77、沈Q IDN0:79、沈QIDN0:81、沈QIDN0:83 和沈QIDN0:85。
[0024] 本文還提供一種如上所述的分離的核酸序列，其編碼多膚，該多膚與具有從由如 下序列構成的群組中選出的氨基酸序列的多膚具有至少60%的序列同一性：SEQIDN0:2、 SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDN0:10、WQIDN0:12、WQIDN0:14、WQ IDNO: 16、沈QIDNO:28、沈QIDNO:30、沈QIDNO:32、沈QIDNO:34、沈QIDNO:36、沈Q IDNO:38、沈QIDNO:40、沈QIDNO:42、沈QIDNO:44、沈QIDNO:46、沈QIDNO:48、沈Q IDNO:50、沈QIDNO:52、沈QIDNO:54、沈QIDNO:56、沈QIDNO:58、沈QIDNO:60、沈Q IDNO:62、沈QIDNO:64、沈QIDNO:66、沈QIDNO:68、沈QIDNO:70、沈QIDNO:72、沈Q IDNO:74、沈QIDNO:76、沈QIDNO:78、沈QIDNO:80、沈QIDNO:82、沈QIDNO:84 和 沈QIDNO:86。
[0025] 本文還提供一種分離的多膚，其包含與從由如下序列構成的群組中選出的氨基酸 序列具有至少60%序列同一性的氨基酸序列：SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQ IDNO:8、SEQIDNO: 10、沈QIDNO: 12、沈QIDNO: 14、沈QIDNO: 16、沈QIDNO:28、沈Q IDNO:30、沈QIDNO:32、沈QIDNO:34、沈QIDNO:36、沈QIDNO:38、沈QIDNO:40、沈Q IDNO:42、沈QIDNO:44、沈QIDNO:46、沈QIDNO:48、沈QIDNO:50、沈QIDNO:52、沈Q IDNO:54、沈QIDNO:56、沈QIDNO:58、沈QIDNO:60、沈QIDNO:62、沈QIDNO:64、沈Q IDNO:66、沈QIDNO:68、沈QIDNO:70、沈QIDNO:72、沈QIDNO:74、沈QIDNO:76、沈Q IDNO:78、沈QIDNO:80、沈QIDNO:82、沈QIDNO:84 和沈QIDNO:86。
[00%] 還提供一種細胞，其經(jīng)重組修飾W表達如上所述的多膚。
[0027] 還提供用于鑒定結合至嗎I噪和/或糞臭素氣味受體的化合物的分析方法。特別 是，本文提供一種鑒定化合物的方法，該化合物阻斷、抑制、調節(jié)和/或提高被從嗎I噪和糞 臭素中選出的化合物激活的嗅覺受體的活性，該方法包括：
[0028]a)將該受體或嵌合體或片段與化合物接觸；
[0029] b)分析該化合物是否對該受體的活性具有影響；其中，該受體為如上所述的多 膚。
[0030] 在一個實施方案中，化合物的活性是通過比較其結合至嗎I噪和/或糞臭素而確定 的。在另一個實施方案中，受體與化合物是在糞臭素和/或嗎I噪的存在下在允許該化合物 連同糞臭素和/或嗎I噪結合至該受體的條件下接觸的。
[0031] 在本文提供的進一步的實施方案中，當功能分析用于測定結合活性時，測定本文 提供的受體的信號傳導活性的步驟可W包括檢測第二信使水平的變化。在另一個實施方 案中，提供了信號傳導活性的測定，其中，測定信號傳導活性的步驟包括鳥嚷嶺核巧酸結合 /偶聯(lián)或交換、腺巧酸環(huán)化酶活性、環(huán)憐酸腺巧（cAMP)、蛋白激酶C活性、蛋白激酶A活性、 憐脂酷肌醇擊穿、二酷基甘油、Ξ憐酸肌醇、細胞內巧、巧烙劑、花生四締酸、MAP激酶活性、 酪氨酸激酶活性、黑素細胞分析、受體初始化分析、或報道基因的表達。在本文提供的具體 實施方案中，信號傳導活性的測定包括使用巧光或發(fā)光測定法。巧光和發(fā)光測定可W包括 使用化化敏感的巧光團，包括00flu03Flu0415或化ra，（分子探針）；化3-試劑盒系列 (MolecularDevice)和水母發(fā)光蛋白。
【附圖說明】
[0032] 圖1顯示的是惡臭受體脫孤過程的示意性概述。
[003引圖2顯示了Ca2+成像示蹤，顯示了同時由嗎I噪和糞臭素特異性激活的6個獨立的 嗅覺感覺神經(jīng)元（每個50微米）。
[0034] 圖3示出了使用本文描述的步驟鑒定出的惡臭受體基因。
[0035] 圖4A和圖4B顯示使用本文描述的步驟鑒定出的01化740(4A)和01化665(4B)族 中人與另外小鼠的惡臭受體。
[0036] 圖5A至圖祀示出了在肥K293T細胞中的小鼠OR01化743、01化746和01化740 的嗎I噪和糞臭素的活性。
[0037]圖 6A至圖 6J示出 了在肥K293T細胞中的人類 0R52N2、0R11G2、0R5AC2、0R4C15、 0R8S1、0R11冊和0R11H4W及小鼠01化665和01化740的嗎I噪和糞臭素的活性。 陽03引 圖7示出了試驗化合物的肥K293T細胞中嗎I噪受體01化743活性的抑制。
【具體實施方式】
[0039] 對于此處的說明書化及隨附的權利要求書，除非另有說明，"或"的使用意味著'嘴 / 或"。同樣，"包含"、"包括"、"含"廣comprise"、"comprises"、"comprising"、"include"、 "includes"和"including")可互換使用且并非用于限制。
[0040] 還應理解的是，盡管各種實施方案的描述使用了術語"包含"，但本領域技術人員 應理解，在某些特定情形中，某實施方案可使用措辭"主要由……組成"或"由……組成"來 替代描述。 定義
[0042] 除非另有說明，如下術語具有歸屬于它們的含義。
[0043] "OR"是指在嗅覺細胞中表達的一族G蛋白偶聯(lián)受體中的一個或多個成員。嗅覺受 體細胞還能在形態(tài)的基礎上得W鑒定或通過在嗅覺細胞中特異性表達的蛋白質的表達得 W鑒定。OR族成員可具有充當嗅覺轉導受體的能力。 W44]"嗎I噪"和/或"糞臭素OR"是指在嗅覺細胞中表達的一族G蛋白偶聯(lián)受體中的一 員，該受體在鑒定結合和/或激活GPCR的配體的結合或活性分析方法中通過嗎I噪和/或糞 臭素結合和/或激活。該分析方法如下所述。本文的嗎I噪和/或糞臭素受體將包括片段、 變體（包括合成的和天然存在的）和相應于或結合至嗎I噪和/或糞臭素的嵌合體。 W45] "OR"核酸編碼具有屯個跨膜區(qū)并具有"G蛋白偶聯(lián)受體活性"的一族GPCR，例如， 它們可W響應于細胞外刺激而結合至G蛋白，并且通過酶例如憐脂酶C和腺巧酸環(huán)化酶的 刺激促進生產(chǎn)第二信使例如IP3、cAMP、cGMP和Ca2\
[0046] "OR"多膚被認為是運樣的，它們屬于屯跨膜結構域G蛋白偶聯(lián)受體超家族，由單 個至化b的長外顯子編碼，并且表現(xiàn)出特性嗅覺受體特異性氨基酸基序。運屯個結構域被 稱為"跨膜"或"TM"結構域TMI至TMVII，它們由Ξ個"內部細胞環(huán)"或稱"1C"結構域 1CI至1CIII，化及Ξ個"外部細胞環(huán)"或稱"EC"結構域ECI至ECIII連接?；蚨x 為，但不限于，重疊TMIII和1CII的MAYDRYVAIC基序，重疊1CIII和TMVI的FSTCSSH 基序，TMVII中的PMLNPFIY基序，W及ECII中的Ξ個保守C殘基，和TMI中高度保守GN 殘基的存在（（ZhangandFirestein(2002),TheOlfactoiyRec巧torGeneSupe;rfamily oftheMouse.NatureNeuroscience:5(2):124-33；Malnicetal. ,TheHumanOlfactory Rec巧torGeneFamily:PNAS:101(8):2584-9).)。
[0047] "N末端結構域"區(qū)開始于N末端并延伸至靠近第一跨膜區(qū)的開始的區(qū)域。包括屯 個"跨膜區(qū)"的"跨膜結構域"是指位于質膜內的OR多膚的結構域，并且還可W包括相應的 細胞質（細胞內）和細胞外環(huán)。運屯個跨膜區(qū)w及細胞外和細胞質環(huán)可w使用標準方法來 鑒定，如描述于Kyte&Doolittle、J.Mol.Biol.、157:105-32 (1982)，或描述于St巧er。跨膜 結構域的一般的二級和Ξ級結構，特別是G蛋白偶聯(lián)受體如嗅覺受體的屯個跨膜結構域是 本領域公知的。因此，一級結構序列可W基于已知跨膜結構域序列來設計或預測，如下面詳 述。運些跨膜結構域可用于試管內配體結合分析，可溶相和固相均可。
[0048] 在調節(jié)由嗅覺轉導所介導的OR族成員的測試化合物的分析方法的語境中，短語 "功能性分析"包括間接或直接在受體的影響下任何參數(shù)例如功能性、物理和化學效應的確 定。其包括配體結合、離子通量改變、膜電位、電流、轉錄、G蛋白結合、GPCR憐酸化或去憐酸 化、信號轉導的受體-配體相互作用、第二信使?jié)舛龋ɡ?，cAMP、cGMPIP3或胞內Ca2+)、 試管內、體內和體外，并且還包括其他生理效應例如神經(jīng)遞質或激素釋放的增加或降低。本 文所包括的是對增加或減少間接或直接在OR族成員的影響下的參數(shù)，例如功能性、物理和 化學效應的化合物的功能性分析。運種功能分析或效果可通過本領域技術人員公知的任何 手段來測定，例如，分光特性（例如，巧光、吸收度、折射率）、流體動力學（例如，形狀）、色 譜或溶解度特性、膜片錯、壓敏染料、全細胞電流、放射性同位素流出、可誘導標記、卵母細 胞OR基因表達的變化，組織培養(yǎng)細胞OR表達，OR基因的轉錄活化，配體結合分析，電壓、膜 電位和電導的變化，離子通量分析，細胞內第二信使如cAMP、cGMP和Ξ憐酸肌醇（IP3)的變 化，細胞內巧水平的變化，神經(jīng)遞質釋放等。 W例OR基因或蛋白的"抑制劑"、"活化劑"、"沖消劑"和"調節(jié)劑"可互換使用，指的是 使用體外、試管內和體內嗅覺轉導分析鑒定的抑制性、激活或調節(jié)分子，例如配體、激動劑、 括抗劑和它們的同源物和模擬物。抑制劑是例如結合、部分或完全阻斷刺激、降低、防止、延 遲活化、失活、脫敏或下調嗅覺轉導的化合物，例如括抗劑。活化劑是例如結合、刺激、增加、 打開激活、促進、增強激活、敏化或上調嗅覺轉導的化合物，例如激動劑。調節(jié)劑包括例如改 變受體與下述物質的相互作用的化合物：結合活化劑或抑制劑的