一種玉米多堆柄銹菌的單孢擴繁方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物病菌的單孢擴繁方法，具體地說，涉及一種玉米多堆柄銹菌的單孢擴繁方法。
【背景技術】
[0002]玉米多堆柄銹菌可以引起玉米南方銹病，1972年首次在我國海南發(fā)現(xiàn)，2003年以后，該病在我國20多個省份都有發(fā)生，因此該病從次要病害升為主要病害。玉米成為我國的第一大糧食作物，因此防治玉米南方銹病迫在眉睫。
[0003]公開號為CN102146439A和CN102174647A的中國專利申請分別公開了普通型和南方型玉米銹病病原真菌的檢測引物及分子檢測方法，但并未公開如何得到玉米柄銹菌單孢擴繁體系。
[0004]近幾年，玉米南方銹病開始得到大家的重視，其中在研究其群體遺傳時，所用的菌應該是純菌系，而由于受到沒有擴繁單孢系方法的限制，所用的菌系從葉片上直接刮取的大量單孢子堆，這是一種混合菌系，不是純菌系，因此對其研究結果具有影響。另外其他研究也受到沒有該方法而無法開展。也有利用單個孢子進行研究，但需要使用試劑盒，成本高，限制了對大量樣品的研究。
[0005]玉米南方銹病很多研究需要基于純的菌系開展，該菌是轉性寄生菌，只能在活的玉米植株上存活和繁殖，擴繁單孢系比較困難，國內外也沒有報道過玉米多堆柄銹菌單孢系的擴繁。因此現(xiàn)在亟需一套玉米多堆柄銹菌單孢擴繁體系，即得到純化后的菌系。

【發(fā)明內容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種玉米多堆柄銹菌的單孢擴繁方法。
[0007]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術方案如下:
[0008]—種玉米多堆柄銹菌的單孢擴繁方法，挑取病葉上的玉米多堆柄銹菌的單孢子堆接種到健康玉米苗上，繁殖后利用新的健康玉米苗先后經轉接和噴接，獲得擴繁的單孢系；所述健康玉米苗為三葉一心苗期的玉米苗。
[0009]所述病葉為田間采集的玉米南方銹病病葉，病葉上的一個單孢子堆往往由一個單孢子繁殖而來。
[0010]選擇三葉一心苗期的健康玉米苗進行接菌，玉米苗更易發(fā)病。
[0011 ] 進一步地，所述方法包括如下步驟:
[0012](一)種苗;
[0013](二)菌種初繁:挑取病葉上的玉米多堆柄銹菌的單孢子堆接種到健康玉米苗葉片上；
[0014](三)單孢系轉接:待初繁的玉米苗發(fā)病后，將生長在葉片上的全部孢子挑接到健康的玉米苗上；
[0015](四)收集孢子粉；
[0016](五)單孢系噴接:將收集的孢子粉配制成孢子懸浮液，以噴霧的形式接種到多株健康的玉米苗上，得到足夠的孢子粉；
[0017]其中，步驟(二)接菌到健康玉米苗的第二葉和/或第三葉上，每片葉子只接種一個單孢子堆；步驟(三)和(五)同時接菌到多株健康玉米苗的第二葉和第三葉上。
[0018]需要說明的是，當需要擴繁的單孢子堆為多個時，可以接菌到多株健康玉米苗上。利用多少玉米苗，第二葉和第三葉是否均接種，取決入實際擴繁目標，在此基礎上所做的調整，不偏尚本發(fā)明宗旨。
[0019]每株接種第二葉和第三葉，是由于第一葉容易干枯，第二和第三葉開始發(fā)病時，第四葉還沒長好，因此能夠更加充分地利用營養(yǎng)。
[0020]進一步地，步驟(二)、(三)和(五)中，玉米苗接菌后，20-30°C的條件下，保濕(濕度100% )24-48h，之后轉移到光照充足，空氣相對濕度80%以上，溫度20_30°C的環(huán)境條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
[0021]孢子的萌發(fā)需要水，在上述溫度濕度條件下，可保證孢子的萌發(fā)率最高。保濕之后的玉米苗轉移到光照充足的溫室或培養(yǎng)箱里繼續(xù)培養(yǎng)，光照充足有利于葉片營養(yǎng)的制造，進而更有利于產孢。
[0022]進一步地，獲得的孢子量不夠噴接時，所述步驟(三)和步驟(五)，可轉接或噴接1?3代。
[0023]進一步地，所述健康玉米苗在接菌之前，對玉米苗的第二片葉和第三片葉進行脫蠟處理。
[0024]進一步地，所述步驟(二)和步驟(三)在接菌前，利用0.05%吐溫20處理脫蠟葉片。對玉米苗進行脫蠟處理，利于菌的侵染。
[0025]所述脫蠟處理可選擇本領域的常規(guī)手段，例如，可用酒精消毒后的手指輕輕摸去葉片上的蠟質。
[0026]接菌時，所述步驟(二 )在脫蠟的葉片上均勻噴灑0.05%吐溫20，然后用消毒的挑針或注射器挑取感染南方銹病的玉米葉片上邊緣清晰的單孢子堆，轉接到脫蠟處理后的玉米葉片上。
[0027]初繁時，挑取玉米葉片上邊緣清晰的單孢子堆，防止被其他菌系污染。
[0028]進一步地，所述步驟(三)在脫蠟的葉片上均勻噴灑0.05%吐溫20后，用消毒的挑針或注射器，挑取步驟(二)培養(yǎng)的孢子，均勻接種到脫蠟后的葉片上；均勻接種有利于在葉片上發(fā)病均勻。
[0029]進一步地，所述步驟(五)直接在葉片上噴孢子懸浮液。不用先噴灑0.05%吐溫20，孢子懸浮液里的水分足夠孢子的萌發(fā)。
[0030]進一步地，步驟(一)包括玉米種子催芽和播種；玉米種子催芽方法具體為:選取飽滿的玉米種子，用0.1%的雙氧水在室溫條件下浸泡種子24h-48h，倒掉液體或取出種子，在種子上面蓋上濕紙巾或濕布，在室溫通風處催芽一天。
[0031]如果浸泡時間短，則發(fā)芽較慢，若浸泡時間長，則由于缺氧，發(fā)芽率明顯降低。
[0032]進一步地，所述步驟(一)中，玉米種子前端長出l_2mm胚根后即可播種，播種時，胚根朝上且朝向種植容器的中心。這樣能夠使第一葉和第三葉都向內生長，第二葉向外生長，方便接菌和收菌。
[0033]進一步地，所述步驟(五)中，孢子懸浮液的配制方法為:每l_5mg孢子粉加10-20ml 0.05%吐溫20。之后，可使用噴壺等用具使孢子懸浮液以噴霧的形式對玉米苗進行噴接，進一步擴大單孢系的繁殖。
[0034]本發(fā)明的有益效果在于:
[0035]本發(fā)明提供的玉米多堆柄銹菌單胞系擴繁體系，在提供的樣品單孢子堆邊緣清晰，沒有其他污染的情況下，初繁成活率90 %以上，噴接成功率99%。潛育期只有4-5天，接菌第7天開始產孢，15到20天產生大量孢子。而成株玉米潛育期需要20天，大大縮短了繁菌時間。因此該方法具有時間短、成活率高的特點，對于研究玉米南方銹病的研究，提供了繁菌基礎。
【附圖說明】
[0036]圖1為本發(fā)明玉米種植方