一種cik細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] CIK細(xì)胞（cytokineinducedkiller，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞）是一種新型 的免疫活性細(xì)胞，它是自體外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)多種細(xì)胞因子共同誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的一類 CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子共同表達(dá)的殺傷細(xì)胞。CIK細(xì)胞具有抗腫瘤活性和非MHC殺 瘤特性，是一種具有增殖速度快，殺瘤活性高，殺瘤譜廣等特點(diǎn)的效應(yīng)細(xì)胞。
[0003] 樹突狀細(xì)胞（Dendriticcells，DC)是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞（Antigen presentingcell,APC)，是唯一能夠刺激初始T淋巴細(xì)胞成熟的APC，能夠?qū)⒖乖f呈給 ⑶8+T淋巴細(xì)胞，從而發(fā)揮T淋巴細(xì)胞的殺傷作用。
[0004] 由于腫瘤是低免疫原性的疾病，故機(jī)體中的初始T細(xì)胞不能有效的識(shí)別和殺傷腫 瘤細(xì)胞，即腫瘤抗原不被DC遞呈就不能有效識(shí)別和誘導(dǎo)出抗腫瘤免疫。DC可遞呈豐富的腫 瘤抗原肽占據(jù)相應(yīng)的T細(xì)胞受體，并通過(guò)分泌協(xié)同刺激分子、趨化因子，激活、聚集和增強(qiáng) T細(xì)胞，產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞具有特異性作用的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，殺掉腫瘤細(xì)胞； 同時(shí)分泌大量的白細(xì)胞介素-12 (IL-12)增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。
[0005] CIK細(xì)胞和DC共培養(yǎng)能顯著增加樹突狀細(xì)胞和共刺激分子遞呈抗原的特異性。此 外，兩者共培養(yǎng)還能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞IL-12的分泌和CIK細(xì)胞的毒性，而IL-12攝取阻斷 則會(huì)減弱CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。因此，將CIK細(xì)胞和DC聯(lián)合起來(lái)治療惡性腫瘤，有助于解 決部分腫瘤患者的T細(xì)胞的免疫無(wú)能，從而發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)有技 術(shù)常常將DC和CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，以其增強(qiáng)CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，殺傷腫瘤細(xì)胞。例如專利 CN104357394A公開(kāi)了一種自體外周血淋巴細(xì)胞DC-CIK的培養(yǎng)方法，專利CN103642754A公 開(kāi)了一種高毒性、高增殖能力的人D-CIK細(xì)胞的制備方法，專利CN104450616A公開(kāi)了一種 DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞的共培養(yǎng)方法。
[0006] DC細(xì)胞雖然可以促進(jìn)CIK細(xì)胞的增殖及殺傷活性，但是DC細(xì)胞必須經(jīng)過(guò)體外的擴(kuò) 增培養(yǎng)，且擴(kuò)增的效果還不是很理想，擴(kuò)增能力較差。且DC細(xì)胞的擴(kuò)增體系需用到多種細(xì) 胞因子，甚至有的現(xiàn)有方法還加入了某些單抗，造成了DC和CIK細(xì)胞共培養(yǎng)方法的復(fù)雜程 度和成本。
[0007] 更為重要的一點(diǎn)，現(xiàn)有的方法所培養(yǎng)的CIK細(xì)胞殺傷活性、效應(yīng)細(xì)胞比例 (⑶3+⑶56+)普遍不高，同時(shí)分泌IL-2、IFN-γ細(xì)胞因子的能力也不理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，使得所述方法更加 簡(jiǎn)便有效，無(wú)需進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)和添加多種細(xì)胞因子和單抗，同時(shí)保證CIK細(xì)胞的增殖 及殺傷活性較高，成本較低。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，使得所述方法顯著提高 培養(yǎng)出的CIK細(xì)胞中的效應(yīng)細(xì)胞（CD3+CD56+)數(shù)量。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，使得所述方法顯著提高 誘導(dǎo)培養(yǎng)出的CIK細(xì)胞的殺傷活性。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，使得所述方法提高 培養(yǎng)出的CIK細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ的能力。
[0012] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0013] -種CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括：
[0014] 步驟1、將Β細(xì)胞用含有Flt3因子和IL-2的免疫細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，然后加入腫瘤 抗原刺激B細(xì)胞；
[0015] 步驟2、將CIK細(xì)胞和步驟1的經(jīng)過(guò)腫瘤抗原刺激后的B細(xì)胞共培養(yǎng)，并補(bǔ)加含 IL-2的免疫細(xì)胞培養(yǎng)基共培養(yǎng)，定期補(bǔ)充含IL-2的免疫細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0016] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有DC和CIK細(xì)胞共培養(yǎng)的缺點(diǎn)，選擇B淋巴細(xì)胞替代DC和CIK細(xì) 胞進(jìn)行共培養(yǎng)。B淋巴細(xì)胞，即骨髓依賴性淋巴細(xì)胞，亦可簡(jiǎn)稱B細(xì)胞，是體內(nèi)唯一可以產(chǎn) 生抗體的細(xì)胞。在外周血中占淋巴細(xì)胞總數(shù)的10%-15%。在抗原的刺激下，B淋巴細(xì)胞 被激活、增殖，產(chǎn)生抗體，介導(dǎo)特異性體液免疫應(yīng)答；同時(shí)，B淋巴細(xì)胞還具有免疫調(diào)節(jié)的功 能，它可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞以及T細(xì)胞的功能。 另外活化的B淋巴細(xì)胞還具有加工和提呈抗原的作用。
[0017] 本發(fā)明中B細(xì)胞從單個(gè)核細(xì)胞分選出后無(wú)須像DC那樣進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)，也不需 要添加很多種的細(xì)胞因子和單抗，僅需加培養(yǎng)基重懸后用腫瘤抗原刺激即可以和CIK細(xì)胞 共培養(yǎng)，降低了培養(yǎng)方法的復(fù)雜程度以及成本，同時(shí)保證了CIK細(xì)胞增殖及殺傷活性不低 于DC和CIK細(xì)胞共培養(yǎng)的效果。
[0018] 其中，本發(fā)明所采用B細(xì)胞可以通過(guò)現(xiàn)有任何常規(guī)方法收集獲得，本發(fā)明提供由 單個(gè)核細(xì)胞通過(guò)CD19分選試劑盒分選出的優(yōu)選方案，所述CD19分選試劑盒為市售產(chǎn)品， 是用來(lái)將B淋巴細(xì)胞從外周血或臍血的單個(gè)核細(xì)胞中分選出來(lái)的一類產(chǎn)品，可購(gòu)自于STEM CELL公司。同時(shí)，對(duì)于CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)也可采用常規(guī)方法，本發(fā)明提供CIK細(xì)胞由單個(gè) 核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的優(yōu)選方法，作為進(jìn)一步的優(yōu)選：
[0019] 將單個(gè)核細(xì)胞用X-VIV0 15培養(yǎng)基重懸，按照1X106-2X106/ml的密度接種在細(xì) 胞培養(yǎng)瓶中，并加入500-1500U/mLIFN-λ，在37°C、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì) 胞；
[0020] 第 2 天補(bǔ)加 50-150U/mL的IL-1a、10-50ng/ml的 0KT-3 以及 100-1000U/ml的 IL-2溶液繼續(xù)培養(yǎng)，整個(gè)CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程為14天。其中，所述IFN-λ濃度在本發(fā) 明的一些【具體實(shí)施方式】中可以選擇為500U000或1500U/mLIFN-λ，而IL-la可以選擇 為 50、100 或 150U/mL，0KT-3 可以選擇為 10、30 或 50ng/ml，IL-2 可以選擇為 100、550 或 1000U/ml〇
[0021] 在上述獲得B細(xì)胞和CIK細(xì)胞的方案中，單個(gè)核細(xì)胞的分離可參照本領(lǐng)域已有的 分離方法，本發(fā)明提供優(yōu)選地的方案：
[0022] 外周血離心收集下層血細(xì)胞加生理鹽水稀釋，加入淋巴分離液后離心，棄上層液 體，加水生理鹽水洗滌，再次離心后去上清，獲得單個(gè)核細(xì)胞。
[0023] 作為優(yōu)選，步驟1為：
[0024] 將B細(xì)胞用含有Flt3因子和IL-2的免疫細(xì)胞培養(yǎng)基重懸并在5%的二氧化碳濃 度，95%的濕度的37°C培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)1天，然后加入腫瘤抗原刺激B細(xì)胞36-48h。
[0025]作為更優(yōu)選地，步驟1所述Flt3因子的濃度為10-20ng/ml，IL-2的濃度為 10-50U/ml。在本發(fā)明的一些【具體實(shí)施方式】中，所述Flt3因子的濃度可以為10、15或20ng/ ml，而IL-2 的濃度可以為 10、20、30、40 或 50U/ml。
[0026] 作為優(yōu)選，步驟2所述CIK細(xì)胞和B細(xì)胞的體積比為10:1;
[0027] 作為優(yōu)選，步驟2所述共培養(yǎng)為在在5%的二氧化碳濃度，95%的濕度的37°C培養(yǎng) 箱中共培養(yǎng)14天；
[0028] 作為優(yōu)選，步驟2所述共培養(yǎng)中CIK細(xì)胞密度為1 X 106/ml;
[0029] 作為優(yōu)選，步驟2所述IL-2濃度為100-1000U/ml;在本發(fā)明的一些【具體實(shí)施方式】 中，所述IL-2 濃度可以為 100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000U/ml。
[0030] 作為優(yōu)選，所述免疫細(xì)胞培養(yǎng)基為X-VIV0 15培養(yǎng)基。
[0031] 按照本發(fā)明所述培養(yǎng)方法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面的抗原標(biāo)志 物，如⑶3和⑶56。⑶3+⑶56+為CIK細(xì)胞中的效應(yīng)細(xì)胞，CIK細(xì)胞是一群異質(zhì)的細(xì)胞群， 其CD3+CD56+雙陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞越多，其殺傷活性會(huì)更好。結(jié)果顯示，本發(fā)明CIK細(xì)胞中 ⑶3+⑶56+效應(yīng)細(xì)胞比例為29. 6%，而現(xiàn)有技術(shù)方法的比例為16. 6%。
[0032] 此外，對(duì)K562細(xì)胞的殺傷性檢測(cè)結(jié)果顯示，本發(fā)明所培養(yǎng)的CIK細(xì)胞殺傷活性為 顯著高于現(xiàn)有技術(shù)方法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞。同時(shí)在CIK細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ的能力方面也 有提尚。
[0033] 基于上述試驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明提供了Β細(xì)胞在培養(yǎng)CIK細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0034] 由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明選擇Β淋巴細(xì)胞替代傳統(tǒng)的DC作為和CIK細(xì)胞共培 養(yǎng)的細(xì)胞，通過(guò)B細(xì)胞和CIK細(xì)胞之間的相互作用促進(jìn)CIK細(xì)胞增殖和殺傷活性的提高，同 時(shí)又避免了DC體外擴(kuò)增培養(yǎng)和添加多種細(xì)胞因子和抗體的復(fù)雜操作，整體工藝得到簡(jiǎn)化， 相比現(xiàn)有方法更加具有優(yōu)勢(shì)。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1所示為CIK細(xì)胞的流式檢測(cè)結(jié)果，其中A表示現(xiàn)有技術(shù)方法的CIK細(xì)胞流式 檢測(cè)結(jié)果，B表示本發(fā)明所述方法的流式檢測(cè)結(jié)果；
[0036] 圖2所示為IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值；
[0037] 圖3所示為IL-2標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi) 容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行 了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的產(chǎn)品及方法進(jìn) 行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0039] 為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方