脂肪酶固定化載體及其酶固定方法及提高拆分性能的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及固定化脂肪酶催化手性拆分技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種脂肪酶固定化載 體及其固定脂肪酶的方法以及一種利用固定化脂肪酶提高手性拆分性能的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酶因其具有多功能性、特異選擇性等特征作為生物型催化劑而廣泛應(yīng)用于工 業(yè)生產(chǎn)中。然而游離型脂肪酶在有機(jī)溶劑中不穩(wěn)定、易聚集結(jié)塊狀而失活，同時(shí)經(jīng)過大批量 催化生產(chǎn)后，后期產(chǎn)物分離提純過程復(fù)雜，經(jīng)濟(jì)費(fèi)用較高。因此為改善自由酶的催化性能， 通常通過固定化技術(shù)將脂肪酶固定在載體材料表面，如硅土、陶瓷、碳納米管材料、高分子 聚合物及樹脂上，繼而克服脂肪酶在催化過程中存在的穩(wěn)定性、重復(fù)使用性差以及產(chǎn)物與 催化劑不易分離的問題。脂肪酶本身相對疏水，在適當(dāng)?shù)氖杷暂d體表面簡單的物理性吸 附是有效的固定化方法。脂肪酶界面吸附在疏水性載體上可引起其構(gòu)象發(fā)生變化而超活 化。
[0003] 目前，許多報(bào)道關(guān)于對載體材料表面進(jìn)行不同功能化基團(tuán)改性，主要是在一些合 成高分子材料表面接枝疏水性基團(tuán)。如Guisan等人將多種脂肪酶固定在四種改性的疏水 性載體上（丁基、辛基瓊脂糖和己基、丁基樹脂）水解拆分外消旋2-丁酰苯乙酸，比較各載 體上脂肪酶對映體選擇率E值大?。籔arshad等人將Arthrobactersp脂肪酶固定在不同 疏水程度的烷基化環(huán)氧丙基樹脂大孔隙共聚物催化拆分外消旋乙基-3-羥基-3-苯丙酸， 其對映體選擇性及催化活性比自由酶均有明顯提高。
[0004] 膽汁酸來源于生物體內(nèi)，是良好的生物型表面活性劑，根據(jù)其特殊的平面兩親性 結(jié)構(gòu)特征以及含羧基端的烴基長鏈，因此通過膽汁酸羧基端與聚合物高分子表面基團(tuán)反應(yīng) 很容易接枝達(dá)到改性目的，并且膽汁酸其疏水面提供了與脂肪酶疏水性相互作用，誘導(dǎo)脂 肪酶活性部位"蓋子"打開，與脂肪酶"蓋子"內(nèi)側(cè)疏水部分作用誘使脂肪酶固定在改性聚 合物表面；其親水面羥基團(tuán)通過與底物氫鍵作用以及膽汁酸留醇族骨架本身含有手性識別 特征，與脂肪酶在手性拆分效果中能達(dá)成一定程度上的協(xié)調(diào)效果?；谶@一因素，本發(fā)明將 采用膽汁酸或膽汁酸鹽作為載體改性材料制備手性選擇功能載體用于脂肪酶固定化以及 催化拆分外銷旋化合物反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決有機(jī)溶劑中固定化脂肪酶穩(wěn)定性差、重復(fù)使用性差、催化活性低、對映體 選擇率低等問題，本發(fā)明提供了一種可有效提高有機(jī)相中游離脂肪酶催化活性及穩(wěn)定性的 脂肪酶固定化載體。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種脂肪酶固定化載體，所述的 脂肪酶固定化載體由分子結(jié)構(gòu)上引入氨基的高分子載體材料與膽汁酸或膽汁酸鹽脫水縮 合制得。
[0007] 由于膽汁酸具有含羧基端或磺酸基端的烴基長鏈，因此其很容易通過羧基或磺酸 基與分子表面含有氨基基團(tuán)的高分子載體材料反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)接枝改性的目的。
[0008] 本發(fā)明所述高分子載體材料分子表面氨基基團(tuán)的引入，可采用現(xiàn)有技術(shù)中常用的 胺基化方式。
[0009] 作為優(yōu)選，所述高分子載體材料為聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯 腈、聚甲基丙烯酸甲脂、纖維素、尼龍、殼聚糖、海藻酸鈉或硅凝膠中的至少一種。
[0010] 作為優(yōu)選，所述膽汁酸為膽酸、脫氧膽酸、鵝去氧膽酸、石膽酸、?；悄懰帷⑴；敲?氧膽酸、牛磺熊膽酸或甘氨膽酸中的至少一種。其中，膽酸可用縮寫符號：CA表示；脫氧膽 酸可用縮寫符號：DCA表示；鵝去氧膽酸可用縮寫符號：CDCA表示；石膽酸可用縮寫符號： LCA表示；?；悄懰峥捎每s寫符號：TCA表示；?；敲撗跄懰峥捎每s寫符號：TDCA表示。 [0011] 作為優(yōu)選，所述膽汁酸鹽為膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、鵝去氧膽酸鈉、石膽酸鈉、?；悄?酸鈉、?；敲撗跄懰徕c、?；切苣懰徕c或甘氨膽酸鈉中的至少一種。其中，膽酸鈉可用縮寫 符號：NaC表示；脫氧膽酸鈉可用縮寫符號：NaDC表示；鵝去氧膽酸鈉可用縮寫符號：NaCDC 表示；石膽酸鈉可用縮寫符號：NaLC表示；?；悄懰徕c可用縮寫符號：NaTC表示；?；敲撗?膽酸鈉可用縮寫符號：NaTDC表示。
[0012] 基于上述的脂肪酶固定化載體材料，本發(fā)明包括一種固定化脂肪酶的制備方法， 該方法為：將脂肪酶與所述的脂肪酶固定化載體按照1:1. 8-1:10的比例，放置于pH為4-8 的緩沖溶液中，在溫度為15-60°C下反應(yīng)3-20小時(shí)后，用緩沖溶液洗滌，并將制備得到固定 化脂肪酶真空冷凍干燥。制備所得的固定化脂肪酶，由于改性高分子載體材料的作用，可以 穩(wěn)定且均勻地分散在有機(jī)溶劑中，且脂肪酶的活性部位處于打開狀態(tài)。
[0013] 作為優(yōu)選，所述的緩沖溶液為硼酸鹽緩沖溶液、檸檬酸鹽緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶 液或三羥甲基甲烷緩沖溶液中的至少一種。
[0014] 作為優(yōu)選，所述的脂肪酶為胰脂肪酶，所述的胰脂肪酶為豬胰脂肪酶（PPL)或柱 狀假絲酵母脂肪酶（CRL)，所述的豬胰脂肪酶（PPL)或柱狀假絲酵母脂肪酶（CRL)來源于根 霉、曲霉、青霉、毛霉、假單胞菌、豬胰或牛胰中的至少一種。
[0015] 基于上述的固定化脂肪酶，本發(fā)明還包括一種提高脂肪酶手性拆分性能的方法， 該方法為：將利用上述方法制備所得的固定化脂肪酶加入有機(jī)溶劑中，再加入底物（R， S)-手性醇以及乙酸乙烯酯或乙酸異丙烯酯，混合均勻后，在10-55Γ下，反應(yīng)10-72小時(shí)， 利用HPLC檢測R型和S型手性醇脂的生成量，確定固定化脂肪酶的對映體選擇率。
[0016] 本發(fā)明利用固定化脂肪酶催化拆分手性化合物的反應(yīng)機(jī)理如下式所示：以手性醇 R，S-1-苯乙醇為例：在有機(jī)溶劑環(huán)己烷中，將R，S-1-苯乙醇與脂肪酶、乙酸乙烯酯混合并 反應(yīng)，得到產(chǎn)物為R型乙酸苯乙酯和S型苯乙醇，將R型乙酸苯乙酯水解即可得到R型苯乙 醇。
[0017]
[0018] 作為優(yōu)選，所述的底物（R，S)_手性醇為1-苯乙醇、薄荷醇、泛醇、雌馬醇、烯唑醇、 戊唑醇、己唑醇或氨基醇中的任一種。
[0019] 作為優(yōu)選，所述的有機(jī)溶劑為為丁燒、戊燒、己燒、環(huán)己燒、庚烷、辛烷、壬燒、癸烷、 苯、甲苯或乙苯中的至少一種。
[0020] 本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0021] 1、本發(fā)明所述的脂肪酶固定化載體通過膽汁酸與脂肪酶產(chǎn)生疏水性作用，誘導(dǎo)脂 肪酶活性部位"蓋子"打開，并與脂肪酶"蓋子"內(nèi)側(cè)疏水部分作用誘使脂肪酶固定在改性 高分載體材料表面，繼而既提高了固定化脂肪酶的穩(wěn)定性，也保證了脂肪酶的催化活性。
[0022] 2、本發(fā)明所述的固定化脂肪酶中，膽汁酸具有特殊的平面兩親性結(jié)構(gòu)，其親水面 羥基團(tuán)通過與手性底物產(chǎn)生氫鍵作用以及膽汁酸留醇族骨架本身含有手性識別特征，與脂 肪酶在手性拆分效果中能達(dá)成一定程度上的協(xié)調(diào)效果，繼而可以有效提高對手性化合物的 拆分活性。
[0023] 3、本發(fā)明建立了一種在非水相中提高固定化脂肪酶催化拆分外消旋化合物的方 法，實(shí)現(xiàn)了讓脂肪酶除在水環(huán)境中水解反應(yīng)外的酯交換、轉(zhuǎn)酯化等眾多其它反應(yīng)方式，充分 利用脂肪酶作為生物催化劑的優(yōu)點(diǎn)，并且手性功能載體材料作為自由酶吸附材料改善了脂 肪酶在有機(jī)相中分布混亂、生成物與催化劑難以分離的缺陷。同時(shí)手性功能載體材料易合 成，價(jià)格適宜，酶吸附在手性載體上，不僅熱力學(xué)穩(wěn)定性提高，催化拆分效果也得到了增強(qiáng)， 并且可重復(fù)多次利用，滿足了低成本、高收率的產(chǎn)業(yè)化模式生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0024] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可 以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0025] 圖1為經(jīng)6種膽汁酸或膽汁酸鹽改性后的高分子載體材料聚丙烯腈膜ATR-IR圖 譜。
[0026] 圖2為6種脂肪酶固定化載體對豬胰脂肪酶或柱狀假絲酵母脂肪酶吸附值數(shù)值 圖。
[0027] 圖3為自由酶與6種不同固定化脂肪酶對映體選擇率數(shù)值圖。
[0028] 符號及英文翻譯：PAN為聚丙烯腈；PAN-NH2為氨基聚丙烯腈；PAN-CA為膽酸改性 聚丙烯腈；PAN-DCA為脫氧膽酸改性聚丙烯腈；PAN-LCA為石膽酸改性聚丙烯腈；PAN-TCA 為?；悄懰岣男跃郾╇?；PAN-TCDA為?；敲撗跄懰岣男跃郾╇?；PPL為豬胰脂肪酶；CRL為柱狀假絲酵母脂肪酶；freelipase自由脂肪酶。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以下實(shí)施例是對本發(fā)明的解釋而 本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。
[0030] 實(shí)施例1:
[0031] 本實(shí)施例1以高分子載體材料聚丙烯腈（PAN)為例。
[0032] -種脂肪酶固定化載體，所述的脂肪酶固定化載體由分子結(jié)構(gòu)上引入氨基基團(tuán)的 聚丙烯腈與膽汁酸鹽或膽汁酸通過酸胺縮合的方式制備得到。
[0033] 具體制備步驟如下：
[0034]S1:稱取一定質(zhì)量的聚丙烯腈加入到2mol/LNaOH溶液中，在65°C下水浴振蕩2h， 洗凈調(diào)pH酸化，烘干，得羧基化聚丙烯腈；
[0035]S2:稱取一定質(zhì)量步驟S1制備得到羧基化聚丙烯腈加入無水四氫呋喃溶液中，再 加入氯化亞砜，50°C油浴回流反應(yīng)24h，反應(yīng)畢，旋干得酰氯化聚丙烯腈，再將酰氯化聚丙烯 腈加入無水四氫呋喃中，加入乙二胺，在冰水浴反應(yīng)48h，洗滌烘干，得胺基化聚丙烯腈；
[0036]S3:稱取