一種花色調(diào)節(jié)基因VwMYB29及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種花色調(diào)芐基因VWMYB29及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] MYB(Myoblastoma)是一類最早于1941年從動物成肌細(xì)胞瘤中分離出來的轉(zhuǎn) 錄調(diào)控基因（Graf，1992)。而第一個從植物中分離得到的MYB基因是玉米的C1基因 ((Paz-Aresetal.，1987)。隨后又從多種植物中分離得到了功能各異的MYB基因（Waites etal., 1998；Miyakeetal., 2003；Chenetal., 2006)〇
[0003]Cone等（1986)從玉米（Zeamays)中克隆的第一個調(diào)節(jié)花色素合成的單一型MYB 基因一C1基因，它主要特異性的調(diào)節(jié)糊粉層花色素的生物合成，而P1基因則負(fù)責(zé)玉米其他 部位的花色素的合成。Kobayashi等（2002)以巨峰葡萄（Vitislabruscana)為材料，從中 克隆出了V1MYBA基因，并利用粒子轟擊基因瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)將該類基因?qū)肫咸洋w細(xì)胞胚， 從中誘導(dǎo)出紅紫色斑點(diǎn)的產(chǎn)生，最后得出結(jié)論V1MYBAcDNA的導(dǎo)入誘導(dǎo)了UFGT基因的表 達(dá)，從而產(chǎn)生色斑。謝吉容等（2008)利用SSH以及RACE-PCR方法，從月季紅花突變體（Rose hybrida'YesterdayLove'）中克隆出了含有1個MYB結(jié)構(gòu)域的RhMYB基因。通過RT-PCR 技術(shù)證明RhMYB基因與月季花色素合成酶基因CHS在紅花上存在正相關(guān)關(guān)系，但其在以野 生型為對照的試驗(yàn)中表達(dá)量很低，這說明RhMYB蛋白對月季紅花突變體花青素合成存在正 調(diào)控。Gao等（2011)利用從蘋果（MalusXdomestica)中克隆的MdMYB6基因，將其導(dǎo)入擬 南芥，再通過Real-timePCR技術(shù)分析花色素生物合成途徑中各基因的表達(dá)量，得出轉(zhuǎn)基因 擬南芥中CHS、FLS、CHI、UFGT、DFR等表達(dá)量都少于野生型擬南芥，從而得出MYB轉(zhuǎn)錄因子 MdMYB6抑制了相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，使得花色素合成途徑中花青素的積累受阻。Zhang等 (2009)將單一重復(fù)結(jié)構(gòu)域的MYB基因AtCPC轉(zhuǎn)入煙草，獲得了全部或者部分抑制色素表達(dá) 的類型，在部分抑制的類型里出現(xiàn)了中肋有色素的花斑類型，而這些轉(zhuǎn)基因植株的NtDFR、 NtANS和Nt3GT基因都受到了較強(qiáng)的抑制。Nakatsuka等（2012)從日本龍膽（Gentiana triflora)中得到了GtMYBP3和GtMYBP4基因，通過瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn)GtMYBP3和GtMYBP4基因 能夠加強(qiáng)類黃酮生物合成早期FNSII和F3'Η基因啟動子的活性，而且GtMYBP3還能強(qiáng)化 CHS基因啟動子的活性，再將GtMYBP3和GtMYBP4基因轉(zhuǎn)化到煙草花瓣中，結(jié)果導(dǎo)致了煙草 花瓣中花青素量降低，出現(xiàn)了白化的花瓣。Aharoni等（2001)將草莓中的FaMYBl轉(zhuǎn)入煙 草，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FaMYBl基因的過表達(dá)降低了類黃酮生物合成途徑中酶的活性，從而減少了花 青素和黃酮醇的積累，使得花瓣著色受到影響。邵文婷（2013)利用同源克隆方法得到茄子 中SmMYB基因，對其進(jìn)行熒光半定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SmMYB基因在紫茄果皮中的表達(dá)量顯著 高于紫茄其他組織及白茄各組織，再對紫茄進(jìn)行遮光處理，發(fā)現(xiàn)果皮中花青素含量與SmMYB 和SmDFR基因表達(dá)水平呈正相關(guān)，由此得出SmMYB基因正向調(diào)控茄子花青素合成的結(jié)論。溫 超（2012)利用基因槍法介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，將αΜΥΒ導(dǎo)入到中國水仙的花瓣和副冠中， 成功誘導(dǎo)出了紅色的斑點(diǎn)，從而證明了外源轉(zhuǎn)錄因子αΜΥΒ對水仙的花色素苷代謝途徑產(chǎn) 生了影響，并誘導(dǎo)了結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，使花瓣發(fā)生了顏色的變化。
[0004]綜上所述，MYB轉(zhuǎn)錄因子通過與花色素生物合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生特異性結(jié) 合，從而在轉(zhuǎn)錄水平上激活或抑制結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，控制花色素的生物合成，最終影響植物 花色的形成。
[0005] 但目前還未有人從三色堇中克隆得到的花色調(diào)芐基因，并用于調(diào)節(jié)三色堇和月季 花色方面的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種花色調(diào)芐基因VwMYB29及其編碼的蛋白質(zhì)和含 有該基因的重組植物表達(dá)載體。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是提供上述花色調(diào)芐基因VwMYB29在調(diào)節(jié)三色堇和月季花 色中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的第一個目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種花色調(diào)芐基因 VwMYB29,該花色調(diào)芐基因VwMYB29的核苷酸序列如SEQIDN0 :1中所示。
[0009] -種由上述花色調(diào)芐基因VwMYB29編碼的蛋白質(zhì)，所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如 SEQIDN0 :3 中所示。
[0010] 本發(fā)明以三色堇花瓣為原料，提取其總RNA，再將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成CDNA第一鏈，以該 cDNA第一鏈為模板，根據(jù)VwMYB29的同源基因設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR和RECE的方法擴(kuò)增 拼接獲得全長cDNA序列，該全長cDNA序列的長度是900bp，其核苷酸序列如SEQIDN0. 2 所示，SEQIDNO. 2中下劃線部分為其開放閱讀框，開放閱讀框長度為600bp，將此開放閱 讀框命名為花色調(diào)芐基因VwMYB29,其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，由該花色調(diào)芐基因 VwMYB29編碼的蛋白的氨基酸序列具有199個氨基酸殘基，其序列如SEQIDN0. 3中所示， 將該蛋白命名為VwMYB29蛋白，其中5'端非編碼區(qū)120bp，3'端非編碼區(qū)180bp，并包括一 個llbp的poly⑷尾巴。
[0011] 經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對顯示，MYB29有2個重復(fù)結(jié)構(gòu)域（15~62,68~111)，為典型的 R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。
[0012] 一種含有上述VwMYB29基因的重組植物表達(dá)載體。
[0013] 優(yōu)選的，所述的重組植物表達(dá)載體中的植物表達(dá)載體為PBI221。
[0014] 本發(fā)明的第二個目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：上述VwMYB29基因在調(diào)節(jié)植 物花色中的應(yīng)用。
[0015] 優(yōu)選的，所述的植物為三色堇或月季。
[0016] 本發(fā)明將VwMYB29基因與載體pBI221正向相連后得到重組質(zhì)粒pBI 221-MYB29 (重組植物表達(dá)載體），將該重組質(zhì)粒經(jīng)基因槍法轉(zhuǎn)化三色堇和月季后，能促使 三色堇花瓣無色細(xì)胞出現(xiàn)顏色，月季花瓣淺色細(xì)胞出現(xiàn)深紅色斑點(diǎn)。因此，該VwMYB29基因 能用于調(diào)節(jié)三色堇和月季的花色。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明中的花色調(diào)芐基因VwMYB29基因具有誘導(dǎo)三色堇無 色花瓣細(xì)胞產(chǎn)生顏色、月季花瓣淺色細(xì)胞出現(xiàn)深紅色色斑的作用，顯示該基因具有改變花 色的作用，將來可用于三色堇、月季花色育種，培育出具備更深顏色的新品種。
【附圖說明】
[0018] 圖1為實(shí)施例2中的重組質(zhì)粒pBI221-MYB29圖譜；
[0019] 圖2是實(shí)施例2中的重組質(zhì)粒pBI221-MYB29的雙酶切電泳圖，其中M:DL 2000Marker, 1:ρΒΙ221-MYB29,2 ：MYB29；
[0020] 圖3為實(shí)施例3中的經(jīng)基因槍轟擊后的三色堇和月季花的顯微鏡圖，其中A圖為 三色堇，B圖為月季，方框代表導(dǎo)入基因后花色出現(xiàn)的變化，說明該基因可改變花色。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0022] 實(shí)施例1VwMYB29基因的獲取
[0023]1、三色堇花瓣總RNA提取
[0024] 三色堇花瓣總RNA的提取方法采用李琴等（2013)的改良Trizol法，獲得的總RNA 利用1. 2 %的瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測。
[0025] 2、三色堇花瓣MYB基因的克隆
[0026] 2. 1三色堇MYB基因cDNA全長克隆引物設(shè)計(jì)
[0027] 利用PrimerPremier5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)3'RACE、5'RACE、全長擴(kuò)增引物（表 1)〇
[0028] 表1三色堇MYB基因3'RACE、5'RACE、全長擴(kuò)增引物
[0029]
[0030] 2. 2三色堇MYB基因的全長克隆
[0031] (l)MYB基因cDNA3'末端快速擴(kuò)增
[0032]以三色堇總RNA為模版，根據(jù) 3'-FullRACECoreSetwithPrimeScriptTM RTase(TaKaRa)的使用說明書合成3'RACE的cDNA第一鏈，然后按照以下反應(yīng)體系和反應(yīng)條 件對MYB29基因的3'末端進(jìn)行套式PCR。
[0033] 外聚合酶鏈反應(yīng)OuterPCR
[0034] 以逆轉(zhuǎn)錄獲得的3'RACEcDNA第一鏈為模版，按表2配制反應(yīng)液。
[0035] 表2三色堇MYB基因3'末端OuterPCR反應(yīng)體系
[0036]

[0037] 反應(yīng)條件：
[0038]
[0039] 內(nèi)聚合酶鏈反應(yīng)InnerPCR
[0040] 以第一次OuterPCR的反應(yīng)產(chǎn)物為模版，按表3配制反應(yīng)液。
[0041] 表3三色堇MYB基因3'末端InnerPCR反應(yīng)體系
[0042]

[0043] 反應(yīng)條件：
[0044]
[0045] (2)MYB基因cDNA5'末端快速擴(kuò)增
[0046] 以三色堇總RNA為模版，根據(jù)5'-FullRACEKitwithTAP(TaKaRa)的使用說明 書合成5'RACE的cDNA第一鏈，然后按照如下體系（表6)對MYB8和MYB29進(jìn)行5'末端的 快速擴(kuò)增。
[0047] 外聚合酶鏈反應(yīng)OuterPCR
[0048] 以逆轉(zhuǎn)錄獲得的5'RACEcDNA第一鏈為模版，按表4配制反應(yīng)液。
[0049] 表4三色堇MYB基因5'末端OuterPCR反應(yīng)體系
[0050]
[0051] 反應(yīng)條件：
[0052] 94 "C 3：min
[0053]
[0054] 內(nèi)聚合酶鏈反應(yīng)InnerPCR
[0055] 以第一次OuterPCR的反應(yīng)產(chǎn)物為模版，按表5配制反應(yīng)液。
[0056] 表5三色堇MYB基因5'末端InnerPCR反應(yīng)體系
[0057]
[0058] 反應(yīng)條件：
[0059]
[0060] (3)MYB基因全長擴(kuò)增
[0061] 在獲得MYB基因完整3'末端和5'末端序列后，利用DNAMAN等軟件進(jìn)行序列拼接， 從而得到全長序列，再根據(jù)獲得的序列設(shè)計(jì)全長引物，按以下步驟進(jìn)行全長擴(kuò)增。
[0062] 表6MYB基因全長擴(kuò)增反應(yīng)體系
[0063]
[0064] 反應(yīng)條件：
[0065]
[0066]
[0067] 2. 4PCR產(chǎn)物目的片段回收
[0068] 參照快捷型瓊脂糖DNA回收試劑盒II型（BioTeke)回收凝膠中的目的基因。
[0069] 2. 5PCR產(chǎn)物目的片段TA克隆
[0070] 利用回收純化的目的基因，用pMD18-TVector進(jìn)行TA克隆。
[0071] (1)用0· 2mL離心管在冰上配制連接液，如表7;
[0072]表7連接反應(yīng)體系
[0073]
[0074] (2) 16°C連接 4 小時(shí)；
[0075] (3)將連接液加入至100μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并在冰上放置半小時(shí)；
[0076] (4)