一種酶法高效制備低分子量魚皮膠原蛋白肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶法高效制備低分子量魚皮膠原蛋白肽的方法，特別涉及一種利 用海洋膠原蛋白酶MCP-01高效制備低分子量魚皮膠原蛋白肽的方法，屬于生物技術(shù)技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國的漁業(yè)產(chǎn)業(yè)歷史悠久，水產(chǎn)品產(chǎn)量占世界的1/3,擁有世界1/4的漁船，1/6 的捕撈量，近70%的養(yǎng)殖產(chǎn)量。全國有漁業(yè)勞動力約1400萬，養(yǎng)殖面積780萬公頃，漁船 100萬艘，漁業(yè)產(chǎn)值6752億元人民幣。2010年我國水產(chǎn)品產(chǎn)量5373萬噸，約占全球產(chǎn)量的 30%。我國作為水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，占世界養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)量的70%以上。據(jù)我國海關(guān)總署統(tǒng)計， 2010年我國水產(chǎn)品出口總額達(dá)到138. 28億美元，繼續(xù)位居世界首位。在如此大的魚類產(chǎn)品 加工中必然會產(chǎn)生大量的魚皮等下腳料，魚皮作為漁業(yè)加工的副產(chǎn)品，其中膠原蛋白的含 量占其蛋白質(zhì)總量的80%以上，而大多數(shù)企業(yè)并未將其加工利用而是直接掩埋丟棄，不僅 會造成環(huán)境污染，更是對資源的一種極大浪費(fèi)。因此以魚皮作為一種新型的膠原資源提取 膠原蛋白或生產(chǎn)新型的食物產(chǎn)品提高魚副產(chǎn)品的附加值，不僅可以緩解巨大的膠原蛋白資 源需求壓力，有效地避開宗教信仰和習(xí)俗爭議，還能有效避免資源浪費(fèi)及環(huán)境污染?？茖W(xué)證 實，天然蛋白質(zhì)經(jīng)水解后所產(chǎn)生的多肽具有免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)降血壓、降血脂、抗疲勞、抗 氧化等生理調(diào)節(jié)功能，是當(dāng)前國際醫(yī)藥界、食品界最熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的功 能因子。膠原蛋白肽可用于開發(fā)多種功能性健康食品；同時，膠原多肽以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu) 和較小的分子量、良好的滲透性、與皮膚良好的相容性等優(yōu)勢，還可作為保濕劑及口服液應(yīng) 用于化妝品和保健品行業(yè)中。
[0003] 膠原蛋白活性肽的獲得方法包括從天然生物體中提取、通過化學(xué)方法和重組DNA 技術(shù)合成、體外水解蛋白質(zhì)等。然而天然產(chǎn)物中活性肽含量很少，只能提取用于試驗研究； 化學(xué)合成法成本高，副產(chǎn)物對人體有害；重組DNA技術(shù)合成法多用于生產(chǎn)長肽和蛋白質(zhì)，而 許多活性肽卻是短肽。所以體外水解蛋白質(zhì)成為獲得活性肽的有效方式。目前已用于商業(yè) 化小肽制備的酶有植物性蛋白酶、細(xì)菌性蛋白酶、中性蛋白酶、動物蛋白酶（胰酶、膠原酶） 等幾大類。這些酶均具有降解膠原蛋白或彈性蛋白的能力。但是目前尚沒有酶解魚皮制備 魚皮膠原蛋白肽的適冷膠原蛋白酶的報道，也沒有商品化的適冷魚皮膠原蛋白酶。
[0004] 目前市面上所售商品化膠原蛋白肽大都是由多種商業(yè)化的酶制劑共同酶解膠原 材料制備而成，普遍存在兩方面的問題：（1)分子量范圍分布廣泛且肽段分子量較高，從 1000~10000不等，不能滿足對分子量更小且分布均一的小肽產(chǎn)品的市場需求，且研究表 明2~5個氨基酸的短肽鏈可以通過兩類肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體直接進(jìn)入血液，即平均分子量低的小 肽更快的被吸收，平均分子量高的短肽受胃消化過程的影響十分顯著，即分子量越高，小肽 的水溶性及組織吸收性都會受到不同程度的影響。（2)酶解魚皮制備膠原蛋白肽的產(chǎn)品得 率較低，酶解過程結(jié)束后，殘留大量未被酶解的魚皮底物，造成大量的魚皮原料的浪費(fèi)，提 高了生產(chǎn)成本，嚴(yán)重降低了企業(yè)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種酶法高效制備低分子量魚皮膠原蛋白肽的 方法。該方法利用適冷蛋白酶MCP-01高效酶解魚皮，獲得低分子量的魚皮膠原蛋白肽，提 尚魚副廣品的附加值，變廢為寶。
[0006] -種酶法高效制備低分子量魚皮膠原蛋白肽的方法，包括如下步驟：
[0007] (1)將預(yù)處理后的魚皮打碎后，按照1~30U/g的量加入MCP-01酶液，在37~ 40°C、150~170rpm，pH為7~7. 5的條件下，酶解0· 5~2h后，制得反應(yīng)液；
[0008] (2)將步驟（1)制得的反應(yīng)液滅酶活，然后經(jīng)固液分離，純化，制得低分子量魚皮 膠原蛋白肽。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中，預(yù)處理后的魚皮為經(jīng)去除脂肪和去除灰分 后的魚皮。進(jìn)一步優(yōu)選的，去除脂肪步驟如下：
[0010] 將魚皮經(jīng)水沖洗干凈后，采用濃度0. 08~0. 12M的NaOH溶液浸泡10~14h，水洗 至中性，制得去除脂肪的魚皮。
[0011] 進(jìn)一步優(yōu)選的，去除灰分步驟如下：
[0012] 將去除脂肪的魚皮浸入濃度為0. 25~0. 35M的鹽酸中3~5h，水洗紙中性，制得 去除灰分的魚皮。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述加入MCP-01酶液后，反應(yīng)體系中打碎后的魚皮與反應(yīng)體 系體積的比例為（〇. 5~1) : 1，單位g/mL。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中每克預(yù)處理后的魚皮加入20U的MCP-01酶 液，酶解時間1. 5h，酶解溫度37°C。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中的MCP-01酶液采用如下方法制備：
[0016] 將深海細(xì)菌（Pseudoalteromonassp. )SM9913活化后，接種于液體種子培養(yǎng)基中， 在15~20°C條件下震蕩培養(yǎng)20~28h，然后按體積百分比1 %~5%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中， 12~18°C震蕩培養(yǎng)72~84h，固液分離，制得MCP-01酶液。
[0017] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述活化為在15~20°C條件下，于活化培養(yǎng)基中活化2~3天；
[0018] 所述活化培養(yǎng)基組分如下，均為重量份：
[0019] 蛋白胨0. 8~1. 0份，酵母粉0. 5~0. 75份、瓊脂1. 0~1. 5份，人工海水100份， pH為 7. 5 ~8. 0。
[0020] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述液體種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量份：
[0021] 蛋白胨0· 8~1. 0份，酵母粉0· 5~0· 75份，人工海水100份，pH為7. 5~8. 0。
[0022] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量份：
[0023] 麩皮 1 份，豆柏 2 份，玉米粉 2 份，CaCl2 0· 1 份，Na2HP04 · 12H20 1 份，ΚΗ2Ρ04 0· 03 份，人工海水100份，pH為8. 0。
[0024] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的固液分離為在4°C、10000~14000rpm離心15~30min。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中滅酶活為在90~100°C的水浴鍋中滅酶活 5 ~10min〇
[0026] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中固液分離為在4°C條件下，13000r/min離心 10 ~15min〇
[0027] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中純化為經(jīng)孔徑為50μm的過濾裝置過濾后，-80 °C冷凍干燥。
[0028] 所述步驟⑴中所述深海適冷菌假交替單胞菌株（Pseudoalteromonas sp.SM9913)，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，菌種 保藏號CCTCCN0:M2010223。
[0029] 有益效果
[0030] 1、通過本發(fā)明所述制備方法獲得的魚皮膠原蛋白肽的得率為：按照鮮魚皮中 21. 0%的干物質(zhì)比例計算，肽粉干重得率（肽粉干重/魚皮干重）約為71. 1 ±2. 8%，尚于 現(xiàn)有酶解方法獲得的產(chǎn)量；
[0031] 2、通過本發(fā)明所述制備方法獲得的魚皮膠原蛋白肽的肽含量為96. 7±0. 35%，高 于現(xiàn)有膠原蛋白肽含量92%;
[0032] 3、通過本發(fā)明所述制備方法獲得的魚皮膠原蛋白肽的肽段分子量集中分布于 300~800之間，肽段分子量小且分布均一，具有更高的水溶性及消化吸收性，預(yù)示著其在 醫(yī)藥、食品、化妝品等高附加值領(lǐng)域中有巨大的應(yīng)用潛力；
[0033] 4、通過本發(fā)明所述制備方法酶解魚皮膠原蛋白肽的酶用量低，極大降低了酶的使 用成本；
[0034] 5、魚皮是魚類加工副產(chǎn)品且含有豐富的膠原蛋白，難以被消化和降解，本發(fā)明用 魚皮為原料，利用酶解的方法制備膠原蛋白肽，不僅提高了魚副產(chǎn)品的附加值，而且具有很 好的環(huán)境效益和社會效益。
【附圖說明】
[0035] 圖1、魚皮底物殘留量與酶解時間、酶用量關(guān)系的曲線圖；
[0036] 圖2、MALDI-T0F圖譜分析魚皮膠原蛋白肽分子量（600-3000)分布情況；
[0037] 圖3、MALDI-T0F圖譜分析魚皮膠原蛋白肽分子量（300-1000)分布情況；
【具體實施方式】
[0038] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于 此。
[0039] 實施例中所述深海嗜冷菌（Pseudoalteromonassp. )SM9913菌株購自中國典型培 養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，菌種保藏號CCTCCN0:M2010223。
[0040] 魚皮購自大魚島集團(tuán)，人工海水為購自青島漁業(yè)市場海鹽按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行配 制獲得，麩皮、豆柏、玉米粉購自山東省農(nóng)