一種萊蕪豬及其肉制品的鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于畜牧養(yǎng)殖技術(shù)，具體地說(shuō)是一種萊蕪豬及其肉制品的鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 萊蕪豬是我國(guó)優(yōu)良的地方品種豬之一，以較高的肌內(nèi)脂肪含量（10%左右)而著稱， 它是一個(gè)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值都很高的豬品種。萊蕪豬因品種獨(dú)特而備受養(yǎng)殖者和消費(fèi)者 的喜愛(ài)，導(dǎo)致市場(chǎng)上很多萊蕪豬或其肉制品的假冒品。準(zhǔn)確而高效的鑒定萊蕪豬或其肉制 品成為一種急需的手段，不僅能夠提供科學(xué)的鑒定方法，而且能夠規(guī)范萊蕪豬的種豬和肉 制品市場(chǎng)，進(jìn)而維護(hù)養(yǎng)殖者和消費(fèi)者的權(quán)益。
[0003]豬品種鑒定的方法主要有外貌鑒定法和分子生物學(xué)技術(shù)法，外貌鑒定法需要特別 有經(jīng)驗(yàn)的經(jīng)紀(jì)人，主要靠看和摸等主觀經(jīng)驗(yàn)對(duì)豬種外表進(jìn)行評(píng)定，有一定的主觀性，鑒定方 法不科學(xué)。分子生物學(xué)技術(shù)鑒定豬的品種方法科學(xué)，結(jié)果可靠，但是需要找到適合本品種的 特異分子標(biāo)記。
[0004] 分子生物學(xué)鑒定豬的品種主要有三種方法：一是用母系遺傳的mtDNA作為標(biāo)記， 這也是最常用的方法，因?yàn)槊總€(gè)豬品種mtDNA的多態(tài)性豐富，基因片段較短。二是父系遺傳 的Y染色體，這種方法使用較少，因?yàn)樨iY染色體上品種特異的標(biāo)記位點(diǎn)很少。三是選擇核 染色體上的微衛(wèi)星標(biāo)記，這種方法相對(duì)較可靠，但是要找到品種特異的微衛(wèi)星標(biāo)記需要的 時(shí)間長(zhǎng)，耗費(fèi)的成本高。到目前為止，用mtDNA作為分子標(biāo)記鑒定品種是最常用的方法，但 是因其多態(tài)性豐富，所以要建立本品種mtDNA所有的多態(tài)位點(diǎn)庫(kù)，關(guān)于萊蕪豬品種及其肉 制品鑒定的研究甚少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種萊蕪豬及其肉制品的鑒定方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為： 一種萊蕪豬及其肉制品的鑒定方法，將待鑒定豬或其肉制品采樣，用本方法提供的引 物進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)可以鑒定該豬種是否是萊蕪豬或其肉制品是否來(lái)自萊蕪 豬。
[0007] 待鑒定豬或其肉制品來(lái)自純種豬，如果是雜交豬，該方法只能鑒定其母親是否來(lái) 源于萊蕪豬。
[0008] 所述的待鑒定豬或其肉制品采樣后提取總DNA，用本方法提供的引物首先進(jìn)行 D-loop區(qū)和Cytb基因的擴(kuò)增測(cè)序，與本方法提供的萊蕪豬D-loop區(qū)和Cytb基因的全群基 因庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。
[0009] 所述的根據(jù)D-loop區(qū)和Cytb基因的比對(duì)結(jié)果初步判斷待鑒定豬是否來(lái)自萊蕪 豬，如果"不是"則立即下結(jié)論，如果"是"則要進(jìn)一步用本方法提供的mtDNA全序引物進(jìn)行 進(jìn)一步的驗(yàn)證。
[0010] 所述的用本方法提供的mtDNA全序引物獲得待鑒定豬的mtDNA基因全序，再與 GENBANK基因庫(kù)中的序列比對(duì)，驗(yàn)證待鑒定豬或其肉制品是否來(lái)自萊蕪豬。
[0011] 所述的用mtDNA全序引物能夠準(zhǔn)確判斷該純種豬或其肉制品是否來(lái)自萊蕪豬，如 果不是來(lái)自萊蕪豬，通過(guò)mtDNA全序比對(duì)可以大致判斷其品種來(lái)源。
[0012] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)： 只擴(kuò)增D-loop區(qū)和Cytb基因進(jìn)行測(cè)序，成本較低，本方法提供了萊蕪豬D-loop區(qū)和Cytb基因的多態(tài)位點(diǎn)庫(kù)，能夠很快排除待鑒定豬及其肉產(chǎn)品不是來(lái)自萊蕪豬。本方法提供 的D-loop區(qū)、Cytb基因以及mtDNA全序引物是豬的通用引物，只要是豬的樣品都能擴(kuò)增出 來(lái)。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1待鑒定豬D-loop區(qū)和Cytb基因與萊蕪豬基因庫(kù)比對(duì)結(jié)果，可以判定該豬或 肉產(chǎn)品不是萊蕪豬。該鑒定豬D-loop區(qū)（圖A)和Cytb基因（圖B)與萊蕪豬基因庫(kù)比對(duì)都 沒(méi)有相同的序列。
[0014] 圖2待鑒定豬D-loop區(qū)和Cytb基因與萊蕪豬基因庫(kù)比對(duì)結(jié)果，可以初步判定該 豬或肉產(chǎn)品可能來(lái)自萊蕪豬，需用mtDNA全序進(jìn)一步驗(yàn)證。該鑒定豬D-loop區(qū)（A圖)與萊 蕪豬D-loop3序列相同，Cytb基因（B圖）與萊蕪豬Cytb2序列相同。
[0015] 圖3本發(fā)明提供的萊蕪豬mtDNA全序與GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的結(jié)果圖，可見(jiàn)萊蕪 豬有特異的mtDNA標(biāo)記位點(diǎn)。
[0016]
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面的實(shí)施例中將本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明不限于此。
[0018] 萊蕪豬的肌內(nèi)脂肪含量高，肉香而鮮美，導(dǎo)致市場(chǎng)上很多假冒的萊蕪豬或其肉制 品。mtDNA有母系遺傳的特點(diǎn)，并且多態(tài)性豐富，檢測(cè)成本低，能夠很好地應(yīng)用于動(dòng)物品種鑒 定中。 實(shí)施例
[0019] 本實(shí)施例中萊蕪豬及其肉制品鑒定的主要目的是判斷待鑒定豬或其肉制品是否 來(lái)自萊蕪豬，為養(yǎng)豬者或消費(fèi)者提供科學(xué)的依據(jù)。本發(fā)明中的萊蕪豬及其肉制品鑒定方法 包括下列步驟： 1)米樣 采取待鑒定豬的耳組織、血液、帶毛囊的毛根或者肉制品（最好是生肉）3-5g，如果不 能立即進(jìn)行試驗(yàn)則應(yīng)把樣品浸泡在無(wú)水乙醇中，血液要加抗凝劑并4 °C保存。
[0020] 2 )提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序 所取樣品用酚仿抽提法提取總DNA，用本方法提供的D-loop區(qū)引物1，F(xiàn): 5'-AGGAGACTAACTCCGCCAT-3'，R: 5'-CTGAGTCCAAGCATCCCCAA-3'，和引物2，F(xiàn): 5'-CGCGCATATAAGCAGGTAAA-3' ，R: 5'-CGCGGATACTTGCATGTGT-3'；Cytb基因的引物F: 5'-GGAATTTAACCACGACCAATGAC-3'，R: 5'-GTGGCCCTCCTTTTCTGGTTTAC-3'；mtDNA全序引物 見(jiàn)表1。按照常規(guī)PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，退火溫度58-64 °C，擴(kuò)增后用PCR液進(jìn)行測(cè)序。
[0021] 表1擴(kuò)增mtDNA全序的引物信息
3)D-loop?α仲。γτο整囚斤少仰,、」金疋定w術(shù)曰米尤術(shù) 將獲得的待鑒定豬的D-loop區(qū)和Cytb基因分別與本方法提供的萊蕪豬序列庫(kù)用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)，如果在提供的序列庫(kù)中沒(méi)有該類型的序列（見(jiàn)圖1)，則可判定 待鑒定豬不是來(lái)自萊蕪豬；如果在提供的序列庫(kù)中有該類型的序列(見(jiàn)圖2)，再用mtDNA全 序引物擴(kuò)增待鑒定豬的mtDNA全序。
[0022] 4)mtDNA全序鑒定是否來(lái)自萊蕪豬 獲得待鑒定豬的mtDNA全序后，在GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，具體步驟為：NCBI-BLAST-nucleotideblast-待鑒定豬mtDNA全序-數(shù)據(jù)庫(kù)選擇Nucleotidecollection (nr/nt)-物種來(lái)源（Susscrofa(taxid:9823))-Optimizefor(Somewhatsimilar sequences(blastn))-FiltersandMasking不設(shè)任何參數(shù)，其他參數(shù)為默認(rèn)值。根據(jù)序列 同源性大小則可判定待鑒定豬是否來(lái)自萊蕪豬，也可大致判定其品種來(lái)源。比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖 3〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種萊蕪豬及其肉制品的鑒定方法，其特征在于：將待鑒定豬或其肉制品采樣，用 本方法提供的引物進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)可以鑒定該豬或其肉制品是否來(lái)自萊蕪 豬。2. 按權(quán)利要求1所述的萊蕪豬及其肉制品的鑒定方法，其特征在于：待鑒定豬或其肉 制品來(lái)自純種豬，如果是雜交豬，該方法只能鑒定其母親是否來(lái)源于萊蕪豬。3. 按權(quán)利要求1或2所述的萊蕪豬及其肉制品的鑒定方法，其特征在于：待鑒定豬或 其肉制品米樣后提取總DNA，用本方法提供的引物首先進(jìn)行D-loop區(qū)和Cytb基因的擴(kuò)增測(cè) 序，與本方法提供的萊蕪豬D-loop區(qū)和Cytb基因的全群基因庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。4. 按權(quán)利要求3所述的萊蕪豬及其肉制品的鑒定方法，其特征在于：根據(jù)D-loop區(qū)和 Cytb基因的比對(duì)結(jié)果初步判斷待鑒定豬是否來(lái)自萊蕪豬，如果"不是"則立即下結(jié)論，如果 "是"則要進(jìn)一步用本方法提供的mtDNA全序引物進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。5. 按照權(quán)利4所述的萊蕪豬及其肉制品的鑒定方法，其特征在于：用本方法提供的 mtDNA全序引物獲得待鑒定豬的mtDNA基因全序，再與GENBANK基因庫(kù)中的序列比對(duì)，驗(yàn)證 待鑒定豬或其肉制品是否來(lái)自萊蕪豬。6. 根據(jù)權(quán)利1和5所述的萊蕪豬及其肉制品鑒定方法，其特征在于：用mtDNA全序引物 能夠準(zhǔn)確判斷該純種豬或其肉制品是否來(lái)自萊蕪豬，如果不是來(lái)自萊蕪豬，通過(guò)mtDNA全 序比對(duì)可以大致判斷其品種來(lái)源。7. 根據(jù)權(quán)利3所述的萊蕪豬及其肉制品的鑒定方法，其特征在于：只擴(kuò)增D-loop區(qū)和 Cytb基因進(jìn)行測(cè)序，與本方法提供的全群萊蕪豬D-loop區(qū)和Cytb基因序列庫(kù)比對(duì)，成本較 低，如果待鑒定豬不是來(lái)自萊蕪豬可以很快斷定。
【專利摘要】本發(fā)明屬于畜牧及其肉制品品種鑒定技術(shù)，具體的說(shuō)是一種萊蕪豬及其肉制品的鑒定方法。利用本發(fā)明提供的引物序列，可以擴(kuò)增待鑒定豬的D-loop區(qū)、Cytb基因和mtDNA全序。我們已經(jīng)建立了全群純種萊蕪豬D-loop區(qū)和Cytb基因的序列庫(kù)，目前純種萊蕪豬在NCBI的GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)也有mtDNA全序。根據(jù)待鑒定豬與萊蕪豬mtDNA核苷酸的差異原理，可以準(zhǔn)確地判定待鑒定豬及其肉制品是否來(lái)自萊蕪豬。本發(fā)明不僅可以鑒定豬品種或肉制品是否來(lái)自萊蕪豬，如果不是還可以大致判定其品種來(lái)源。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105349626
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510647370
【發(fā)明人】于光輝, 宋春陽(yáng), 姜建陽(yáng)
【申請(qǐng)人】青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年2月24日
【申請(qǐng)日】2015年10月9日