[0058] 采用Trizol法提取飼料樣品中的總RNA:無(wú)菌操作將經(jīng)過(guò)充分粉碎混勻的飼料 25g放入含有225mL的滅菌生理鹽水的滅菌廣口瓶?jī)?nèi)，在低溫條件下（4°C)以100轉(zhuǎn)/分 的速度震蕩1. 5個(gè)小時(shí)，配成10%的均勻稀釋液。無(wú)菌操作對(duì)上一步制備的均勻稀釋液進(jìn) 行10倍遞增稀釋，選擇3個(gè)以上適宜的稀釋度稀釋后的稀釋液用于提取總RNA，在飼料稀釋 液中迅速加入lmLTrizol試劑，按Trizol試劑盒（D9108A)說(shuō)明書(shū)提取樣品RNA，RNA提取 的步驟如下：
[0059]①向上述步驟的勻漿裂解液中加入氯仿（RNAisoPlus的1/5體積量，200L)，蓋緊 離心管蓋，用手劇烈振蕩15秒（氯仿沸點(diǎn)低、易揮發(fā)，振蕩時(shí)應(yīng)小心離心管蓋突然彈開(kāi)）。 待溶液充分乳化（無(wú)分相現(xiàn)象）后，再室溫靜置5min。
[0060] ② 12, 000g4°C離心 15min。
[0061] ③從離心機(jī)中小心取出離心管，此時(shí)勻漿液分為三層，S卩：無(wú)色的上清液、中間的 白色蛋白層及帶有顏色的下層有機(jī)相。吸取上清液（通常取450L)轉(zhuǎn)移至另一新的1.5mL 離心管中（切忌吸出白色中間層）
[0062] ④向上清中加入等體積的異丙醇（450L)，上下顛倒離心管充分混勻后，在15~ 30°C環(huán)境中靜置lOmin。
[0063] ⑤12,000g4°C離心lOmin。一般在離心后，試管底部會(huì)出現(xiàn)沉淀。
[0064] 小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇lmL(切勿觸及沉淀），輕輕上 下顛倒洗滌離心管管壁，12,OOOg4°C離心5min后小心棄去乙醇（為了更好地控制RNA中 的鹽離子含量，應(yīng)盡量除凈乙醇）?？稍儆?5%的乙醇lmL清洗一遍。
[0065] 室溫干燥沉淀5~10min(不可以離心或加熱干燥，否則RNA將會(huì)很難溶解），加入 適量的RNase-free水（腸道通常取50L，細(xì)胞、細(xì)菌取20L)溶解沉淀，必要時(shí)可用移液槍輕 輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后置于冰上。
[0066] (2)RNA的濃度檢測(cè)、稀釋
[0067] ①背景的建立：取RNase-free水2L，在微量核酸蛋白檢測(cè)儀NanoDrop2000上建 立空白；檢測(cè)RNase-free水的RNA濃度，在±5ng/L為宜。
[0068] ②檢測(cè)樣品濃度：組織樣品濃度兩次檢測(cè)濃度相差以不超過(guò)50ng/L為宜，兩次測(cè) 量的平均值即為樣品RNA濃度。
[0069] ③ 1. 7〈Α260/Α280〈2· 1 ;基因芯片附加條件：Α260/Α230>2· 0
[0070] ④RNA樣品的稀釋：
[0071] 取XL樣品稀釋，則無(wú)酶水添加量：無(wú)酶水體積Y=(原液濃度/600 - 1)*X(L)， 細(xì)胞、細(xì)菌樣品一般不需要稀釋。
[0072] ⑤稀釋后再次檢查RNA濃度，以600 ± 50ng/L為宜。
[0073] 確保完全消除RNA中的DNA污染，得到純化的RNA樣品，使用微量紫外分光光度 儀測(cè)定濃度，采用1. 〇%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，然后將樣品保存于-80°C下備 用；
[0074] E、反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增
[0075] 反應(yīng)體系 10μL:2· 0μL5XPrimeScriptBuffer2(forRealTime)、0· 5μL PrimeScriptRTEnzymeMixI、0· 5μLRTPrimerMix、0· 5uLRandomPrimers(lOOuM)、 TotalRNA(〈500ng)，RNaseFreedH20 補(bǔ)足至 10. 0μL〇
[0076] 反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)條件：將混勻的反應(yīng)液放置在PCR儀中37°C保溫15min后，85°C 加熱5s最后將反轉(zhuǎn)錄成的cDNA降溫至4°C保藏。合成的cDNA保存在-80°C冰箱中。
[0077] F、實(shí)時(shí)熒光定量PCR
[0078] PCR反應(yīng)體系 25. 0μL:12.5μ1 2xSYBRKPi.emixExTaq1' 10μ mol/L上、下游引物各 0· 5μL,cDNA模板 2· 0μL，dH209. 5μL。
[0079] 熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)：95°C預(yù)變性3min;95°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸 45s，循環(huán)40次，每個(gè)樣品重復(fù)3次，在4°C低溫下保存。
[0080] 所述的雙歧桿菌上下游特異性引物分別是：
[0081] 上游引物為：5' -GTCATCTGCCCGACATCTACAA-3'
[0082] 下游引物為：5 ' -TAGGCTTCAGAGCAACGCAAC-3 '
[0083] 外標(biāo)準(zhǔn)品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0084] 外標(biāo)準(zhǔn)品的制備：提取含有以雙歧桿菌模式菌株的目的基因的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒 DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A值后，計(jì)算出拷貝數(shù)，進(jìn)行10倍系列稀釋，梯度稀釋至109-102 拷貝數(shù)/uL的濃度，以此作為外標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；
[0085] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以不同拷貝數(shù)的陽(yáng)性模板的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過(guò)程中 達(dá)到閾值的初始循環(huán)數(shù)（Ct)為縱坐標(biāo)得到雙歧桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為待測(cè)樣品定量測(cè)定 的參照標(biāo)準(zhǔn)。
[0086] G、結(jié)果及判斷
[0087] 以待測(cè)樣品cDNA和標(biāo)準(zhǔn)品的DNA為模板，用雙歧桿菌的種特異性引物，以相同的 體系同時(shí)進(jìn)行雙歧桿菌的目的基因片段的熒光定量PCR擴(kuò)增，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)樣品的 Ct值求出飼料樣品中雙歧桿菌的起始模板量。
[0088] 實(shí)施例4 :
[0089] 試劑盒特異性檢測(cè)：
[0090] 1)雙歧桿菌定性檢測(cè)的特異性驗(yàn)證：
[0091] 利用實(shí)施例3提供的引物及方法，對(duì)嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、 干酪乳桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、大腸桿菌、陽(yáng)性對(duì)照（含有目的基因的質(zhì)粒為模版）、動(dòng) 物雙歧桿菌、添加有動(dòng)物雙歧桿菌的飼料；陰性對(duì)照（滅菌水）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0092] 結(jié)果顯示：僅泳道7 (添加有動(dòng)物雙歧桿菌的飼料），8陽(yáng)性對(duì)照（含有目的基因的 質(zhì)粒為模版），9 (動(dòng)物雙歧桿菌）產(chǎn)生了特異性的256bp的擴(kuò)增條帶，而其他菌株均沒(méi)有， 表明本發(fā)明提供的引物僅可特異性的檢測(cè)雙歧桿菌。同時(shí)有泳道7的擴(kuò)增結(jié)果可知，本發(fā) 明的提供的樣品預(yù)處理方法可很好的對(duì)雙歧桿菌進(jìn)行分離提?。▓D1)。
[0093] 2)雙歧桿菌定量檢測(cè)特異性驗(yàn)證
[0094] 利用實(shí)施例3提供的方法，以非同種菌做為參照菌株，對(duì)雙歧桿菌定量檢測(cè)進(jìn)行 特異性驗(yàn)證。
[0095] 所用的參照菌株有：嗜酸乳桿菌；植物乳桿菌；保加利亞乳桿菌；干酪乳桿菌；屎 腸球菌；糞腸球菌；青春雙歧桿菌。
[0096]結(jié)果判斷：①循環(huán)閾值（Ct值）< 35，表明PCR過(guò)程中有目標(biāo)DNA的擴(kuò)增，可直接 判定為陽(yáng)性；②待檢樣基因檢測(cè)Ct值在32~40之間，應(yīng)重做實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；再次擴(kuò)增 后的外源基因Ct值仍小于40,且曲線有明顯得對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，并且陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空 白對(duì)照結(jié)果正常，則可判定為陽(yáng)性；再次擴(kuò)增后外源基因Ct值大于40,且陰性對(duì)照、陽(yáng)性 對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果正常，可判定為陰性。
[0097] 結(jié)果表明：在模板為不同菌株DNA，引物為雙歧桿菌特異性引物的條件下，僅在模 板為雙歧桿菌DNA條件下，才能得到具有明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的擴(kuò)增曲線，即雙歧桿菌定量檢 測(cè)具有特異性（圖2)
[0098] 實(shí)施例5 :
[0099] 試劑盒靈敏性檢測(cè)：
[0100] 將雙歧桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間，測(cè)其A值，估計(jì)其菌數(shù)，然后按10 \ 10 2,10 3, 10 4, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8的倍數(shù)稀釋，取最后幾個(gè)梯度的菌液涂平板計(jì)數(shù)，重復(fù)3次，取其 平均值確定其真實(shí)的菌密度。同時(shí)每個(gè)梯度菌液各取3管提取RNA反轉(zhuǎn)為cDNA后，以待測(cè) 樣品cDNA為模板，用實(shí)施例3所述的雙歧桿菌的種特異性引物及方法進(jìn)行雙歧桿菌的目的 基因片段的熒光定量PCR擴(kuò)增（圖3)，并以平板計(jì)數(shù)總菌數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，熒光定量 PCR反應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，得到菌數(shù)與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4)。
[0101] 結(jié)果表明：Ct值為32時(shí)對(duì)應(yīng)的總菌數(shù)即為雙歧桿菌的檢測(cè)下限，即為 4. 7X104cfu，亦即本發(fā)明提供的引物的熒光PCR檢測(cè)的最低檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。
[0102] 實(shí)施例6 :
[0103] 在不含雙歧桿菌的飼料中，添加終濃度為4.07±0. 15X10scfu/g飼料的雙歧桿 菌（平板計(jì)數(shù)菌數(shù)為3· 9X10scfu/g飼料、4· 2X10scfu/g飼料、4. 1X10scfu/g飼料），利 用本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)，得到的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Ct值為18. 68±0. 30 (Ct值分別為 19. 01、18. 44、18. 59)，利用雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線y= -3. 4921x+48. 612(R2 = 0. 9947)，得到飼料中是雙歧桿菌的濃度為3. 77 ±0. 70X10scfu/g飼料（理論菌數(shù)分別為 3.OX10scfu/g飼料、4· 4X10scfu/g飼料、4.OX10scfu/g飼料），經(jīng)SPSS17. 0 統(tǒng)計(jì)分析， 平板計(jì)數(shù)與本發(fā)明的方法得到兩組數(shù)據(jù)差異不顯著（P= 〇. 565)，即本發(fā)明的樣品預(yù)處理 方法結(jié)合所選取目的基因，其檢測(cè)結(jié)果具有準(zhǔn)確性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于飼料中添加的雙歧桿菌的快速定性、定量檢測(cè)試劑盒，包括引物：5'_ GTCATCTGCCCGACATCTACAA_3'、5' -TAGGCTTCAGAGCAACGCAAC-3'''。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，所述試劑盒的使用方法，包括飼料樣品的預(yù)處理方 法，該方法包括： 經(jīng)過(guò)充分粉碎混勻的飼料25g與225mL的滅菌生理鹽水混合，在4°C以100轉(zhuǎn)/分的 速度震蕩1-2h，配成10%的均勻稀釋液；對(duì)均勻稀釋液進(jìn)行10倍遞增稀釋，選擇2個(gè)以上 的稀釋度，根據(jù)需要，提取細(xì)菌基因組DNA或RNA。3. 權(quán)利要求1所述的試劑盒在雙歧桿菌的快速定性中的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1所述的試劑盒在雙歧桿菌定量檢測(cè)中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求1所述的試劑盒在雙歧桿菌的定性和定量檢測(cè)中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求1所述的試劑盒在制備雙歧桿菌檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了用于飼料中添加的雙歧桿菌的快速定性、定量檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法和應(yīng)用，通過(guò)對(duì)已經(jīng)報(bào)道的雙歧桿菌基因組序列的比對(duì)分析，本發(fā)明提供了用于雙歧桿菌定性定量檢測(cè)的引物5’-GTCATCTGCCCGACATCTACAA-3’、5’-TAGGCTTCAGAGCAACGCAAC-3’，同時(shí)本發(fā)明提供了一種飼料樣品的預(yù)處理方法，使得飼料中的益生菌可以充分釋放，準(zhǔn)確真實(shí)的反應(yīng)出飼料中的益生菌數(shù)目。本發(fā)明可以在不進(jìn)行益生菌純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地定性、定量檢測(cè)豬飼料中雙歧桿菌，檢測(cè)程序簡(jiǎn)單、檢測(cè)效率高、準(zhǔn)確性好，靈敏度高，重復(fù)性好。
【IPC分類】C12Q1/68, C12Q1/04, C12R1/01
【公開(kāi)號(hào)】CN105349669
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510856101
【發(fā)明人】吳濤, 侯永清, 趙迪, 丁斌鷹, 易丹, 王蕾, 陳洪波
【申請(qǐng)人】武漢輕工大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年2月24日
【申請(qǐng)日】2015年11月30日