用于鑒定碳青霉烯酶基因的組合物和方法
【專利說(shuō)明】用于鑒定碳青霉烯酶基因的組合物和方法
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00880016405. 7的專利的分案申請(qǐng)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及用于快速鑒定賦予抗生素抗性的克雷伯氏菌屬（Klebsiella)細(xì)菌的 碳青霉烯酶基因的組合物和方法。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 腸桿菌科（Enterobacteriaceae)是一個(gè)大型的細(xì)菌科，包括較熟悉的病原體中 的許多，例如沙門氏菌屬（Salmonella)細(xì)菌和大腸桿菌（Escherichiacoli)。屬于腸桿菌 科的屬的成員已獲得了這樣的名聲，即將它們置于臨床微生物學(xué)中最致病和最常遇到的生 物之中。這些大的革蘭氏陰性桿菌常常與腸道感染相關(guān)，但可以在幾乎所有的天然生境中 發(fā)現(xiàn)。這個(gè)科的許多成員是在人和其他動(dòng)物的腸中發(fā)現(xiàn)的腸道微生物區(qū)系的正常部分，而 其他成員在水或土壤中發(fā)現(xiàn)，或者是在各種不同動(dòng)物和植物上的寄生物。大腸桿菌是最重 要的模式生物之一，并且它的遺傳學(xué)和生物化學(xué)已得到了仔細(xì)研究。
[0005] 肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae)是在口、皮膚和腸的正常微生物區(qū)系 中發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陰性的、不動(dòng)的、有莢膜的、發(fā)酵乳糖的、兼性厭氧的細(xì)菌。它是腸桿菌科的 克雷伯氏菌屬的臨床上最重要的成員。肺炎克雷伯氏菌可以引起細(xì)菌性肺炎，盡管它更通 常地牽涉醫(yī)院內(nèi)泌尿道和傷口感染，特別是在無(wú)免疫應(yīng)答的個(gè)體中。對(duì)于老年人中的泌尿 道感染，克雷伯氏菌屬的排位僅次于大腸桿菌。對(duì)于具有慢性肺病、腸致病性、鼻粘膜萎縮 和鼻硬結(jié)癥的患者，它還是機(jī)會(huì)致病菌。糞便是患者感染的最重要的來(lái)源，隨后為與被污染 的器具接觸。隨著抗生素抗性菌株持續(xù)出現(xiàn)，肺炎克雷伯氏菌日益成為醫(yī)院感染。
[0006] 克雷伯氏菌屬細(xì)菌具有染色體A類β-內(nèi)酰胺酶，該酶給予其對(duì)于氨芐青霉素的 固有抗性。許多菌株已獲得了超廣譜β_內(nèi)酰胺酶（extended-spectrumbeta-lactamase， ESBL)，其具有另外的對(duì)于羧芐青霉素、氨芐青霉素、喹諾酮類的抗性，以及逐漸增加的對(duì)于 頭孢他啶的抗性。碳青霉烯抗生素已成為用于對(duì)付革蘭氏陰性感染的重要試劑，特別是當(dāng) 革蘭氏陰性感染由不同的醫(yī)院病原體引起時(shí)。
[0007] 碳青霉烯類具有任何內(nèi)酰胺抗生素的最廣泛的活性譜，并且通常是用于在由 多重抗性革蘭氏陰性細(xì)菌引起的感染的治療中使用的最合適的試劑。碳青霉烯類被認(rèn)為 是被選擇用于治療由于具有超廣譜內(nèi)酰胺酶（ESBL)的腸桿菌科細(xì)菌而引起的感染的 試劑。產(chǎn)生ESBL的肺炎克雷伯氏菌的流行已在美國(guó)出現(xiàn)，并且在某些地區(qū)中接近分離物的 50%。當(dāng)遇到這樣高比率的產(chǎn)生ESBL的生物時(shí)，碳青霉烯類成為日益重要的治療選擇。在 過(guò)去數(shù)年中，已在某些地區(qū)中觀察到抗碳青霉烯的革蘭氏陰性菌的逐漸增加。在美國(guó)，碳青 霉稀抗性在很大程度上歸于在鮑氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacterbaumannii)、銅綠假單胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)和罕見地肺炎克雷伯氏菌的分離物中C類頭孢菌素酶的表達(dá) 和外膜孔蛋白的喪失。罕見地在肺炎克雷伯氏菌中回收到了水解碳青霉烯的內(nèi)酰胺酶 (碳青霉烯酶）。然而，最近在美國(guó)東北部鑒定了具有碳青霉烯酶KPC-UKPC-2和KPC-3的 分離物。這些分離物通常對(duì)于多種抗生素類別具有抗性，從而給臨床醫(yī)生呈現(xiàn)了非常有限 的治療選擇。
[0008] 引起感染暴發(fā)的高抗性生物的出現(xiàn)是微生物學(xué)和傳染病界已研究了數(shù)年的重大 問(wèn)題。目前，可以將碳青霉烯抗性肺炎克雷伯氏菌的出現(xiàn)添加至正在增長(zhǎng)的高抗性生物列 表中。2005年在紐約市的多個(gè)醫(yī)院中發(fā)生的碳青霉烯抗性肺炎克雷伯氏菌感染的爆發(fā)將廣 泛的關(guān)注帶至這些生物。
[0009] KPC酶是介導(dǎo)對(duì)于超廣譜頭孢菌素類的抗性以及對(duì)于碳青霉烯類的抗性的β-內(nèi) 酰胺酶。2001年在NorthCarolina首次報(bào)道了這些碳青霉稀酶，但目前已在美國(guó)各個(gè)部分 中分離出了它們，最經(jīng)常地在東海岸。產(chǎn)生碳青霉烯酶的分離物的檢測(cè)對(duì)于療法的更好管 理和對(duì)于感染控制是重要的。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 提供了用于快速且靈敏地檢測(cè)賦予抗生素抗性的碳青霉烯酶基因的組合物和方 法。所述組合物包含用于檢測(cè)樣品中該基因的存在情況的寡核苷酸新型引物和探針組。這 些引物和探針組可以在擴(kuò)增方法（例如PCR，特別是定量PCR)中使用，并且包裝到試劑盒中 以用于在擴(kuò)增方法中使用，以便為了檢測(cè)測(cè)試樣品，特別是患者樣品中碳青霉烯酶基因的 存在情況，由此檢測(cè)到該基因表明所述樣品包含對(duì)于碳青霉烯類具有抗性的細(xì)菌。
[0012] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了SEQIDN0 :1、2、4、5、7、8、14、15、17、18和 20中所示的新型寡核苷酸引物，以及SEQIDNO:3、6、9、16和19中所示的新型寡核苷酸探 針序列。這些序列可以在用于檢測(cè)樣品中的碳青霉烯酶基因的方法中使用，所述碳青霉烯 酶基因的存在表明所述樣品包含具有碳青霉烯抗性的細(xì)菌。
[0013] 進(jìn)一步提供了可用于檢測(cè)樣品中的碳青霉烯酶基因的試劑盒，其中所述試劑盒包 含根據(jù)本發(fā)明的組合物。所述試劑盒可以進(jìn)一步包含關(guān)于在基于聚合酶的擴(kuò)增反應(yīng)（例 如，PCR或QPCR)中使用所提供的組合物的指導(dǎo)說(shuō)明書。
[0014] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)使用在該細(xì)菌中存在的靶核酸區(qū)域的基于 聚合酶的擴(kuò)增，來(lái)檢測(cè)樣品中的碳青霉烯酶的方法，所述方法包括：(a)提供懷疑包含具有 碳青霉烯抗性的腸細(xì)菌的測(cè)試樣品，（b)在足以提供基于聚合酶的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物（其包含 編碼碳青霉烯酶的核苷酸序列的靶核酸區(qū)域）的條件下，使所述樣品與本發(fā)明的組合物接 觸；和（c)檢測(cè)所述核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的存在情況，作為測(cè)試樣品中碳青霉烯酶的存在情況的 指示。在各種實(shí)施方案中，所述測(cè)試樣品是直接樣品，并且本發(fā)明的方法和組合物能夠在這 樣的細(xì)菌濃度下檢測(cè)該直接樣品中碳青霉烯酶的存在情況，所述細(xì)菌濃度處于在從被那種 細(xì)菌感染的受試者中收集的樣品中通常發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌負(fù)荷范圍之內(nèi)。
[0015] 本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的引物的用途，其中所述引物或探針具有根據(jù)在SEQID NO:1-9和14-20和14-20中所定義的序列中任一序列的序列。
[0016] 附圖簡(jiǎn)述
[0017] 圖1 :關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)PCR的靈敏度實(shí)驗(yàn)。還將相同的DNA稀釋方案（20ng至2fg)用于 標(biāo)準(zhǔn)PCR引物?？煽康年?yáng)性判讀（call)基于在所有3個(gè)重復(fù)內(nèi)可靠地檢測(cè)出條帶的能力。 使用這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)PCR引物而言可靠的陽(yáng)性是32pg，并因此靈敏度是32pg(l，000個(gè) 基因組等價(jià)物）。
[0018] 圖2 :關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)PCR的直接樣品實(shí)驗(yàn)。還將從尿和血液樣品中提取的DNA用于接 種標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)。在這個(gè)凝膠中未展示的是尿陰性對(duì)照樣品，其在分開的凝膠上走樣并且 不包含任何條帶。除了陽(yáng)性模板對(duì)照（positivetemplatecontrol，PTC)外，沒有樣品產(chǎn) 生條帶。
[0019] 發(fā)明詳述
[0020] I.概覽
[0021] 本文提供了用于檢測(cè)在懷疑具有產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌的樣品中碳青霉烯酶的 存在情況的新型方法和組合物。由于有時(shí)低水平的酶表達(dá)或不易與其他抗性機(jī)制（例如， 不滲性或靶修飾）相區(qū)分，當(dāng)使用常規(guī)易感性測(cè)試方法時(shí)，就碳青霉烯酶產(chǎn)生來(lái)篩選分離 物是困難的。用于檢測(cè)/鑒定碳青霉烯酶的某些表型方法已在文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述，但它們 通常不是標(biāo)準(zhǔn)化的，并且由于所需的專業(yè)水平和/或?qū)ｉT設(shè)備，有些對(duì)于常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室 測(cè)試來(lái)說(shuō)是不可行的。科學(xué)委員會(huì)（例如CLSI)目前未給出關(guān)于用于碳青霉烯酶檢測(cè)的方 法的推薦。因此，對(duì)于用于篩選包含碳青霉烯酶的細(xì)菌的快速且可靠的測(cè)試存在著需要。
[0022] 本發(fā)明的方法和組合物旨在檢測(cè)和/或定量質(zhì)粒承載的（plasmid-borne)β-內(nèi) 酰胺酶基因，更具體地，碳青霉烯酶抗生素抗性基因的質(zhì)粒，并且允許快速地鑒定這種抗生 素抗性基因。在測(cè)試樣品中檢測(cè)到該基因表明所述樣品包含產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌。該方 法涉及使用基于聚合酶的擴(kuò)增方法，特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。如本文中所使用的，"聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"或"PCR"是指用于擴(kuò)增特定多核苷酸模板序列（或"靶核酸"）的體外方法。
[0023] 碳青霉烯酶代表了在腸桿菌科細(xì)菌中重要的新出現(xiàn)的抗性機(jī)制。因此，本發(fā)明的 方法可用于檢測(cè)腸桿菌科成員中的碳青霉烯抗性，所述成員包括但不限于，銅綠假單胞菌、 鮑氏不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiellaoxytoca)、腸桿菌屬物種 (Enterobactersp·)、腸沙門氏菌（Salmonellaenterica)、大腸桿菌等。碳青霉稀酶賦予 針對(duì)碳青霉烯類抗生素的抗性，所述碳青霉烯類抗生素包括亞胺培南、美羅培南和厄他培 南。
[0024] 本發(fā)明的組合物和方法提供了快速且有效的測(cè)試，以用于檢測(cè)樣品中的編碼碳青 霉烯酶或水解碳青霉烯的內(nèi)酰胺酶的基因，并因此檢測(cè)碳青霉烯酶的存在情況。碳 青霉烯酶的檢測(cè)給臨床實(shí)驗(yàn)室提出了問(wèn)題，因?yàn)樘记嗝瓜┟概c陽(yáng)性超廣譜β-內(nèi)酰胺酶 (ESBL)確證測(cè)試（由克拉維酸鹽加強(qiáng)的頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟和氨曲南的活性）相 關(guān)。因此，無(wú)法識(shí)別對(duì)亞胺培南或美羅培南易感的分離物中減少的碳青霉烯易感性的意義 可以導(dǎo)致這些分離物被不正確地鑒定為ESBL產(chǎn)生者。
[0025] II.組合物
[0026] 核苷酸序列
[0027] 來(lái)自幾種肺炎克雷伯氏菌分離物的碳青霉烯酶的核苷酸序列提供在SEQIDΝ0: 10-13中。還將本發(fā)明的引物和探針序列提供為SEQIDNO:1-9和14-20。所述引物和探 針組包括SEQIDN0:1中所示的正向引物，SEQIDN0:2中所示的反向引物，和SEQIDN0: 3中所示的核酸探針；SEQIDNO:4中所示的正向引物，SEQIDNO:5中所示的反向引物，和 SEQIDN0 :6中所示的核酸探針；SEQIDN0 :7中所示的正向引物，SEQIDN0 :8中所示的 反向引物，和SEQIDN0 :9中所示的核酸探針；SEQIDN0 :14中所示的正向引物，SEQID NO:2中所示的反向引物，和SEQIDNO:3中所示的核酸探針；SEQIDNO:4中所示的正向引 物，SEQIDN0 :15中所示的反向引物，和SEQIDN0 :16中所示的核酸探針；SEQIDN0 :20 中所示的正向引物，SEQIDNO:8中所示的反向引物，和SEQIDNO:9中所示的核酸探針； 以及SEQIDNO:17中所示的正向引物，SEQIDNO:18中所示的反向引物，和SEQIDNO:19 中所示的核酸探針。這些引物和探針組可以在基于聚合酶的擴(kuò)增方法（例如，實(shí)時(shí)PCR方 法）中使用，以用于快速地鑒定碳青霉烯酶抗生素抗性基因。所述引物和探針組是通用的， 因?yàn)樗鼈兛梢宰R(shí)別肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶（KPC)基因的所有已知的同種型，以及檢測(cè) 其他腸細(xì)菌中的碳青霉烯酶基因。盡管鑒定了特定的引物和探針序列，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到所述 序列可以通過(guò)核苷酸的添加或置換而發(fā)生改變。
[0028] 樣品來(lái)源
[0029] 可以在實(shí)踐本發(fā)明的方法中使用的代表性生物樣品包括鼻拭子、咽喉拭子、糞便、 皮膚拭子、血液（包括血液培養(yǎng)物）、痰、細(xì)支氣管肺泡灌洗液、支氣管吸出物、肺組織和尿。 生物樣品的收集和貯存方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?？梢酝ㄟ^(guò)鋪板和使細(xì)菌生長(zhǎng)來(lái)對(duì)生 物樣品進(jìn)行加工。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述樣品是直接樣品，并且使所述直接樣品直 接與PCR反應(yīng)組分和合適的寡核苷酸接觸。所述方法特別可用于檢測(cè)體液例如血液和尿中 碳青霉烯酶的存在情況。
[0030] "直接樣品"是這樣的樣品，其收集自受試者并且無(wú)需從樣品中分離或培養(yǎng)細(xì)菌而 在PCR反應(yīng)中進(jìn)行篩選。直接樣品在篩選前一般僅最低限度地進(jìn)行加工。在各種實(shí)施方案 中，樣品可以使用本領(lǐng)域已知的任何可接受的方法來(lái)進(jìn)行裂解，并且進(jìn)行離心以去除細(xì)胞 碎片。保留上清液用于篩選。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在PCR方法中進(jìn)行篩選之前，使核酸形 成粒狀沉淀，洗滌，并重懸浮于合適的緩沖液中。
[0031] 寡核苷酸引物
[0032] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將寡核苷酸引物提供用于檢測(cè)樣品中的碳青霉烯酶 抗生素抗性基因。如本文中所使用的，"引物"是指這樣類型的寡核苷酸，其具有或包含與在 碳青霉烯酶基因中存在的或衍生自碳青霉烯酶基因的靶多核苷酸互補(bǔ)的序列，并且其通過(guò) 堿基配對(duì)與靶多核苷酸雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的正向和反向引物是包含SEQID NO:1、2、4、5、7、8、14、15、17、18和20中所示的核苷酸序列的那些。術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸"是指 短的多核苷酸，長(zhǎng)度通常小于或等于150個(gè)核苷酸（例如，長(zhǎng)度為5-150個(gè)，優(yōu)選地10-100 個(gè)，更優(yōu)選地15-50個(gè)核苷酸）。然而，如本文中所使用的，該術(shù)語(yǔ)還意欲包括更長(zhǎng)或更短的 多核苷酸鏈。
[0033] 本發(fā)明的引物和探針組被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)編碼碳青霉烯酶的核酸分子。本發(fā)明的 組合物被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)編碼碳青霉烯酶的核酸序列的5'、3'和中間部分。本發(fā)明的引物 和探針組中的每一個(gè)可以識(shí)別碳青霉烯酶基因的所有已知的同