一種基于微生物群落產(chǎn)酸指數(shù)的固態(tài)釀造食醋發(fā)酵過(guò)程監(jiān)測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種基于微生物群落產(chǎn)酸指數(shù)的固態(tài)釀造食 醋發(fā)酵過(guò)程監(jiān)測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)食醋的生產(chǎn)歷史悠久，釀造工藝為多菌種混合發(fā)酵工藝，通過(guò)多種微生物的 代謝作用產(chǎn)生風(fēng)味飽滿、酸味柔和的食醋。食醋的生產(chǎn)中有兩個(gè)主要的發(fā)酵階段：酒精發(fā) 酵和醋酸發(fā)酵。在酒精發(fā)酵階段，淀粉質(zhì)原料如糯米、高粱等經(jīng)過(guò)霉菌和酵母菌的一系列代 謝，最終生成酒精；而在醋酸發(fā)酵階段決定食醋風(fēng)味和品質(zhì)的關(guān)鍵步驟，該過(guò)程是由眾多微 生物共同參與發(fā)酵，將乙醇轉(zhuǎn)化為酸類等眾多風(fēng)味物質(zhì)，因此微生物菌群是固態(tài)釀造食醋 廣品風(fēng)味品質(zhì)的保證。
[0003] 目前，我國(guó)眾多食醋生產(chǎn)廠家的食醋發(fā)酵過(guò)程控制都以傳統(tǒng)的操作經(jīng)驗(yàn)為主，主 要按照固定的發(fā)酵方法和發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行操作，發(fā)酵過(guò)程中僅對(duì)溫度、風(fēng)味感官進(jìn)行檢測(cè)，而 對(duì)于固態(tài)醋酸發(fā)酵過(guò)程的結(jié)束終點(diǎn)的判定則依賴于總酸、不揮發(fā)酸等代謝物含量等理化指 標(biāo)，因此整個(gè)固態(tài)醋酸發(fā)酵過(guò)程可控性不高。醋醅中的總酸、不揮發(fā)酸、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等 均為釀醋微生物菌群代謝活動(dòng)的結(jié)果，因此通過(guò)總酸等代謝物指標(biāo)來(lái)跟蹤食醋固態(tài)發(fā)酵過(guò) 程往往具有滯后性，一旦發(fā)現(xiàn)總酸、不揮發(fā)酸含量偏低則難以在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行工藝的及 時(shí)調(diào)整，從而導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)存在批次差異，尤其是產(chǎn)品風(fēng)味差異較大的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。中僅 監(jiān)測(cè)總酸、不揮發(fā)酸含量，未能夠根據(jù)發(fā)酵過(guò)程中微生物的變化情況進(jìn)行工藝參數(shù)的及時(shí) 調(diào)整，另外，而總酸、不揮發(fā)酸、風(fēng)味物質(zhì)等均為微生物的代謝產(chǎn)物，與微生物的變化過(guò)程相 比其存在滯后性。
[0004] 隨著微生物群落高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，人們可以快速地從基因水平上來(lái)研 究特定環(huán)境中微生物的種類、數(shù)量和功能，這在很大程度上有助于人們了解復(fù)雜微生物環(huán) 境的信息。國(guó)內(nèi)外很多研究人員把高通量測(cè)序技術(shù)運(yùn)用到對(duì)糞便、土壤、海底污泥、污水等 體系中原核生物和真核生物的微生態(tài)研究中，同時(shí)在傳統(tǒng)發(fā)酵食品領(lǐng)域也有非常廣泛的應(yīng) 用，其中包括墨西哥發(fā)酵玉米團(tuán)、日本黑醋、朝鮮泡菜、奶酪意大利香腸等的微生物組成和 分布的研究，取得了令人矚目的成果，為我們更好地了解國(guó)內(nèi)外傳統(tǒng)發(fā)酵的機(jī)理提供了理 論基礎(chǔ)，同時(shí)也為傳統(tǒng)發(fā)酵行業(yè)的改革和進(jìn)步提供了寶貴的理論數(shù)據(jù)支撐。
[0005] 本發(fā)明提供了一種基于微生物群落產(chǎn)酸指數(shù)的固態(tài)釀造食醋發(fā)酵過(guò)程的監(jiān)測(cè)方 法。該方法采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中間的醋醅微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定，然 后利用與總酸形成相關(guān)的微生物相對(duì)豐度數(shù)值來(lái)計(jì)算微生物群落產(chǎn)酸指數(shù)，并代入醋醅總 酸預(yù)測(cè)方程計(jì)算該醋醅樣品的總酸含量預(yù)測(cè)值，通過(guò)與醋醅總酸標(biāo)準(zhǔn)變化曲線比較后便能 夠知道該批次發(fā)酵過(guò)程是偏快還是偏慢，并根據(jù)結(jié)果可以及時(shí)調(diào)整發(fā)酵工藝參數(shù)，并及時(shí) 判定和預(yù)測(cè)發(fā)酵結(jié)束時(shí)間。。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有食醋固態(tài)釀造工藝可控性以及批次質(zhì)量不穩(wěn)定 的不足，提供了一種從微生物產(chǎn)酸機(jī)制出發(fā)通過(guò)微生物群落產(chǎn)酸指數(shù)的方法來(lái)監(jiān)控食醋固 態(tài)發(fā)酵的正常進(jìn)行，該方法準(zhǔn)確度較高，為我國(guó)固態(tài)食醋釀造行業(yè)由"經(jīng)驗(yàn)型"控制向"科技 型"轉(zhuǎn)變奠定了理論基礎(chǔ)。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)：首先對(duì)固態(tài)發(fā)酵食醋發(fā)酵過(guò)程中的醋醅樣本進(jìn)行采 樣，并對(duì)醋醅樣本中的微生物群落總DNA進(jìn)行提取，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本基因組的 遺傳發(fā)育標(biāo)記16SrDNA的V1-V3區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序，將醋醅微生物群落中與醋醅總酸形 成有密切相關(guān)性的微生物相對(duì)豐度數(shù)值代入微生物群落產(chǎn)酸指數(shù)計(jì)算方程，并將計(jì)算所得 的產(chǎn)酸指數(shù)代入醋醅總酸含量預(yù)測(cè)方程，從而獲得醋醅總酸含量的預(yù)測(cè)值。醋醅總酸預(yù)測(cè) 值與醋醅總酸變化標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而可以判斷和預(yù)測(cè)該批次固態(tài)發(fā)酵食醋的實(shí)際進(jìn) 度，并指導(dǎo)食醋發(fā)酵參數(shù)的調(diào)整。該方法通過(guò)監(jiān)測(cè)醋醅中與產(chǎn)酸相關(guān)的微生物豐度來(lái)對(duì)食 醋釀造過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控，對(duì)產(chǎn)酸的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度較高，對(duì)控制食醋品質(zhì)有很好的監(jiān)控作用，具體 實(shí)施路線如下：
[0008] (1)醋醅微生物群落總DNA的提?。簭尼劥讖S取樣醋醅樣品100g，在無(wú)菌塑封袋中 充分混勻后取5g醋醅，通過(guò)液氮研磨、溶菌酶處理、氯仿-異戊醇抽提、乙醇洗滌、RNaseA消 化等步驟提取醋醅中微生物群落的總DNA。
[0009] (2)醋醅微生物群落的高通量測(cè)序分析：對(duì)微生物群落總DNA中16SrRNA基因 V1-V3區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行定量。所有擴(kuò)增產(chǎn)物等比例混合后在測(cè)序儀上 進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序產(chǎn)物平均長(zhǎng)度為500bp。測(cè)序分析完成后獲得各類微生物在整個(gè)微生 物群落中的相對(duì)豐度。
[0010] (3)微生物群落產(chǎn)酸指數(shù)的計(jì)算：將醋醅微生物群落中與醋醅總酸形成有正相關(guān) 關(guān)系的微生物（Acetobacter、Acinetobacter)以及與醋醅總酸形成具有負(fù)相關(guān)的微生物 (Lactobacillus、Xanthomonas、Sphingomonas、Rhizobium、Pantoea、Methylobacterium、 Staphylococcus)的相對(duì)豐度代入微生物產(chǎn)酸指數(shù)計(jì)算方程，獲得微生物群落產(chǎn)酸指數(shù)。
[0011] (4)醋醅總酸含量的預(yù)測(cè)：將上述步驟（3)中計(jì)算獲得的微生物群落產(chǎn)酸指數(shù)代 入醋醅總酸含量預(yù)測(cè)方程，從而可以根據(jù)微生物的相對(duì)豐度來(lái)預(yù)測(cè)醋醅總酸含量。
[0012] (5)固態(tài)釀造食醋發(fā)酵過(guò)程的判定：將上述步驟⑷獲得的醋醅總酸預(yù)測(cè)值與醋 醅總酸變化標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而可以判斷和預(yù)測(cè)該批次固態(tài)發(fā)酵食醋的實(shí)際進(jìn)度，并 指導(dǎo)食醋發(fā)酵參數(shù)的調(diào)整。
[0013] 本發(fā)明提供了一種基于微生物群落產(chǎn)酸指數(shù)的方法來(lái)監(jiān)測(cè)食醋固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵 進(jìn)程。通過(guò)測(cè)定微生物群落的相對(duì)豐度并計(jì)算產(chǎn)酸指數(shù)從而判斷發(fā)酵進(jìn)程是偏慢、正常還 是偏快，能夠預(yù)測(cè)發(fā)酵的趨勢(shì)，有助于及時(shí)調(diào)整工藝參數(shù)，并且提前判定發(fā)酵結(jié)束時(shí)間。
【附圖說(shuō)明】：
[0014] 圖1固態(tài)釀造食醋醋醅微生物群落DNA焦磷酸測(cè)序的序列長(zhǎng)度分布
[0015] 圖2醋醅總酸含量標(biāo)準(zhǔn)變化曲線
【具體實(shí)施方式】
[0016] 鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵階段是典型的固態(tài)發(fā)酵過(guò)程，下面以鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過(guò)程為 例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0017] 實(shí)施例1:醋醅微生物群落總DNA的提取
[0018] 1、樣品采集：采集食醋發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的醋醅樣品，樣品采集后如不能及 時(shí)提取DNA應(yīng)立即進(jìn)行冷凍處理。
[0019] 2、醋醅中微生物總DNA提取方法：稱取5g醋醅，在研缽中加入液氮充分研磨，轉(zhuǎn) 移至50mL離心管。向離心管中加入13. 5mLDNA抽提緩沖液和100μL溶菌酶（50mg/mL)， 于225rpm搖床上37°C搖動(dòng)30min。向離心管中加入1.5mL10%SDS，65°C水浴2h，每隔 15-20min輕輕顛倒幾下，室溫6000Xg離心lOmin。收集上清；用等體積的氯仿-異戊醇 (24:1，V/V)抽提一次，以0. 6倍體積的異丙醇室溫沉淀1h，16000Xg離心20min，收集沉 淀，用預(yù)冷的70 %乙醇洗滌沉淀，DNA沉淀干燥后溶于100μLTE中，加入終濃度為0. 5μg/ mLRNaseA，并在37°C下水浴消化2h，以去除RNA，用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證DNA提取的 效果，如果在l〇kb左右出現(xiàn)條帶，則DNA提取成功。
[0020] 實(shí)施例2 :16SrRNA高通量測(cè)序分析醋醅微生物群落結(jié)構(gòu)
[0021] 1.barcode-PCR擴(kuò)增
[0022] 細(xì)菌16S rDNAVfV^PCR擴(kuò)增所用的引物可以擴(kuò)增16S rDNA乂^乂返約500bp 的片段，對(duì)應(yīng)E. coli 16S rDNA 5到534的位點(diǎn)。為方便測(cè)序后序列的提取，每個(gè)樣本對(duì)應(yīng) 一個(gè)含有7個(gè)堿基的barcode序列，即在引物一端加上barcode片段，序列如下：
[0023] Forward: 5 ' -XXXXXXX-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '
[0024] Reverse:5，-XXXXXXX-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3，
[0025] barcode-PCR采用25μL體系，具體如下：
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[0027] barcode-PCR的反應(yīng)條件具體如下：
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