桃兒七中兩個異戊烯基化雙黃酮podoverine B和podoverine C的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及醫(yī)藥領域，特別是一種桃兒屯中兩個異戊締基化雙黃酬podoverineB 和podoverineC的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是一種嚴重威脅人類健康和生命的常見病、多發(fā)病?，F(xiàn)今，癌癥已成為全 世界首要的致死病因。前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一，在美國和歐洲成年男性的 惡性腫瘤中發(fā)病率最高。而隨著人們生活條件逐漸改善，人均壽命不斷延長W及飲食結構 發(fā)生的巨大變化，前列腺癌的發(fā)病率和死亡率在我國均有逐漸升高的趨勢，且發(fā)現(xiàn)時已多 屬中晚期，約有80 %的病人首先被發(fā)現(xiàn)有遠處轉移病灶，然后才確診為前列腺癌。對于轉移 性晚期前列腺癌主要治療方法是內(nèi)分泌治療，然而經(jīng)過幾個月的治療后，對內(nèi)分泌敏感的 前列腺癌常常轉變?yōu)榧に胤且蕾囆颓傲邢侔?，并且對常?guī)治療方案都產(chǎn)生耐受性。中草藥 在抗腫瘤方面的應用歷史悠久，為改變晚期前列腺癌治療的困境，從中草藥中尋找高效低 毒的抗前列腺癌活性物質，研制選擇性強、毒副作用低的新型抗前列腺癌藥物是藥學科研 工作者迫切解決的首要問題。
[0003] 桃兒屯是小築科桃兒屯屬植物鬼白（Sinopodophyllumemodi(Wall.)Ying)的干 燥根及根莖。鬼白是一種具有悠久歷史的藥用植物，古代《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載：殺大 毒，療咳嗽喉疾，風邪煩感，失魄妄見，不入湯。W后的歷代本草亦多有記載，主要用于活血 散結、桂風除濕、蟲蛇咬傷、跌打、屯、胃痛、風寒咳嗽、月經(jīng)不調、鐵棒鍵中毒、風濕筋骨痛及 氣管炎等癥。鬼白分布比較廣泛，我國主要分布在四川、青海、西藏、甘肅、陜西。關于桃兒 屯的化學成分研究表明主要含有木脂素和簡單取代的黃酬類化合物。雙黃酬類化合物首次 在該屬植物中被發(fā)現(xiàn)，該類成分具有重要而廣泛的生物活性如抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、 抗氧化、鎮(zhèn)痛、擴張血管、抗凝血等。雙黃酬類化合物是由兩個黃酬單體經(jīng)過C-C鍵或C-0-C 鍵聚合而成，一般與其他類天然產(chǎn)物共存或在植物體內(nèi)含量較低，且具有復雜的結構，對于 該類成分的提取分離仍舊是一項具有挑戰(zhàn)性的工作。截止目前，異戊締基化雙黃酬類化合 物podoverineB和podoverineC僅僅從植物八角蓮（Podophyllumversipelle)的細胞 培養(yǎng)物中提取分離得到。具體的提取分離過程為，八角蓮的細胞培養(yǎng)物采用甲醇作為溶劑 連續(xù)回流提取，甲醇提取物采用XAD-2Amberlite大孔樹脂柱色譜劃分為Ξ個組分，含有目 標成分的第二個組分經(jīng)過反相制備高效液相色譜進行分離，得到的單體化合物最后再經(jīng)過 色譜柱純化。該提取分離方法設及到3次色譜操作，分離周期較長，并且由于所用的吸附 劑對目標成分的不可逆吸附，會導致樣品的回收率降低。高速逆流色譜是一種新型的無固 相載體的連續(xù)液液分配色譜技術，近年來廣泛應用于生命科學、中醫(yī)藥、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)等領域活 性成分的分離純化。高速逆流色譜技術不需要任何固態(tài)載體，避免樣品與固相載體的作 用而產(chǎn)生樣品的變性、失活和不可逆吸附等，同時還具有高效、快速、樣品制備量大、回收率 高、費用低等優(yōu)點?，F(xiàn)有的異戊締基化雙黃酬類化合物的分離方法中，尚未見凝膠柱色譜法 和高速逆流色譜法相結合用于桃兒屯中異戊締基化雙黃酬單體分離的有關技術報道。據(jù) 文獻報道podoverineB和podoverineC具有抗炎活性，對化學發(fā)光抑制的1C日。值分別為 6. 4X106mol/L和8. 9Xl〇5mol/L。本發(fā)明所設及的podoverineB和podoverineC的逆 流色譜分離和抗腫瘤活性（前列腺癌），迄今為止未見有專利或文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種桃兒屯中兩個 異戊締基化雙黃酬類化合物podoverineB和podoverineC的制備方法，可有效解決快速 從桃兒屯中制備兩個異戊締基化雙黃酬類化合物的問題。
[0005] 本發(fā)明解決的技術方案是，一種桃兒屯中分離的兩個異戊締基化雙黃酬類化合物 podoverineB和podoverineC的制備方法，其分子結構式分別為：
[0006]
陽007] 制備方法是：
[0008] 1)、粗提取物的制備：將桃兒屯3-6kg粉碎成過40目篩的粗粉，用桃兒屯6-12倍 重量的體積濃度為95 %的乙醇90-95°C回流提取2-4次，得乙醇提取液，每次1. 5-2小時， 合并乙醇提取液，減壓濃縮至無醇味，得濃縮物，加濃縮物重量7-12倍的蒸饋水混懸，得混 懸液，加入混懸液等體積的乙酸乙醋萃取3次，合并乙酸乙醋萃取層，減壓回收溶劑，得到 乙酸乙醋萃取部位的浸膏，即為桃兒屯粗提取物；
[0009] 2)、凝膠柱色譜初步分離：對桃兒屯粗提取物經(jīng)凝膠柱色譜初步分離，分別采用體 積比為5 : 5、6 : 4的甲醇-水系統(tǒng)進行梯度洗脫，流速為0. 6-1血/min1，每7-10血為1 個流份，共收集50-60個流份，各個流份經(jīng)硅膠薄層色譜檢測分析，采用GF254薄層板，W體 積比4-6 : 1的二氯甲燒-甲醇作為展開劑，W體積比10 : 90的硫酸-乙醇溶液作為顯 色劑，100-110°C加熱3-5min，根據(jù)薄層色譜檢測結果合并含有目標成分podoverineB和 podoverineC的流份，45°C減壓回收溶劑，得到含有目標成分的濃縮物；
[0010] 3)、高速逆流色譜純化：取體積比為3.5 : 5 : 3.5 : 5的正己燒：乙酸乙醋： 甲醇：水，置于分液漏斗中，充分振搖均勻，靜置10-14小時，分別取上部液相和下部液 相，取含有目標成分的濃縮物各100-200mg，分別加入濃縮物20-50倍重量的上部液相和下 部液相中，超聲溶解，得到含有目標成分的超聲溶液，用高速逆流色譜儀進行純化，方法是： 另取上部液相為固定相、下部液相為流動相，固定相W2mL/min1流速注滿高速逆流色譜儀 的螺旋管，然后轉速調為750-85化/min,同時流動相W2mL/min1流速累入螺旋管，待兩相 在高速逆流色譜儀的色譜柱中達到動態(tài)平衡后，由進樣閥注入超聲溶液，開啟檢測器和記 錄儀進行分離，超聲溶液分離的檢測波長為254nm，溫度為25-27Γ，高速逆流色譜儀轉速 750-85化/min,流動相流速2. 0-2. 2mL/min1，根據(jù)色譜圖分別收集目標成分，減壓回收溶劑 至干，即得兩個異戊締基化雙黃酬類化合物podoverineB和podoverineC。
[0011] 所述方法制備的桃兒屯中兩個異戊締基化雙黃酬類化合物podoverineB和 podoverineC在制備抗前列腺癌藥物中的應用。
[0012] 本發(fā)明方法穩(wěn)定可靠，效率高，時間短，產(chǎn)率高，可快速從桃兒屯中分離得到兩個 異戊締基化雙黃酬類化合物，且純度高，并經(jīng)活性試驗表明對前列腺癌細胞PC-3具有細胞 毒活性，有效用于制備治療前列腺癌的藥物，經(jīng)濟和社會效益顯著。
【具體實施方式】
[0013] W下結合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】作詳細說明。
[0014] 實施例1
[0015] 桃兒屯中分離的兩個異戊締基化雙黃酬類化合物podoverineB和podoverineC 的制備方法，由W下方法實現(xiàn)：
[0016] 1)、粗提取物的制備：將桃兒屯3kg粉碎成過40目篩的粗粉，用桃兒屯12倍重量 的體積濃度為95%的乙醇90°C回流提取3次，得乙醇提取液，每次1. 5小時，合并乙醇提取 液，減壓濃縮至無醇味，得濃縮物，加濃縮物重量12倍的蒸饋水混懸，得混懸液，加入混懸 液等體積的乙酸乙醋萃取3次，合并乙酸乙醋萃取層，減壓回收溶劑，得到乙酸乙醋萃取部 位的浸膏，即為桃兒屯粗提取物；
[0017] 2)、凝膠柱色譜初步分離：對桃兒屯粗提取物經(jīng)凝膠柱色譜初步分離，分別采用體 積比為5 : 5、6 : 4的甲醇-水系統(tǒng)進行梯度洗脫，流速為1血/mini,每7血為1個流份， 共收集55個流份，各個流份經(jīng)硅膠薄層色譜檢測分析，采用GF254薄層板，W體積比5 : 1 的二氯甲燒-甲醇作為展開劑，W體積比10 : 90的硫酸-乙醇溶液作為顯色劑，105°C加 熱3min，根據(jù)薄層色譜檢測結果合并含有目標成分podoverineB和podoverineC的流份， 45°C減壓濃縮回收溶劑，得到含有目標成分的濃縮物；
[0018] 3)、高速逆流色譜純化：取體積比為3. 5 : 5 : 3. 5 : 5的正己燒：乙酸乙醋： 甲醇：水，置于分液漏斗中，充分振搖均勻，靜置12小時，分別取上部液相和下部液相，取 含有目標成分的濃縮物各lOOmg，分別加入濃縮物50倍重量的上部液相和下部液相中，超 聲溶解，得到含有目標成分的超聲溶液，用高速逆流色譜儀進行純化，方法是：另取上部液 相為固定相、下部液相為流動相，固定相W2mL/min1流速注滿高速逆流色譜儀的螺旋管， 然后轉速調為85化/min,同時流動相W2mL/min1流速累入螺旋管，待兩相在高速逆流色譜 儀的色譜柱中達到動態(tài)平衡后，由進樣閥注入超聲溶液，開啟檢測器和記錄儀進行分離，超 聲溶液分離的檢測波長為254皿，溫度為25°C，高速逆流色譜儀轉速85化/min,流動相流速 2mL/min1，根據(jù)色譜圖分別收集目標成分，減壓回收溶劑至干，即得兩個異戊締基化雙黃酬 類化合物podoverineB和podoverineC。
[0019] 實施例2
[0020] 桃兒屯中分離的兩個異戊締基化雙黃酬類化合物podoverineB和podoverineC 的制備方法，由W下方法實現(xiàn)：
[0021] 1)、粗提取物的制備：將桃兒屯5kg粉碎成過40目篩的粗粉，用桃兒屯10倍重量 的體積濃度為95 %的乙醇95°C回流提取2次，得乙醇提取液，每次2小時，合并乙醇提取 液，減壓濃縮至無醇味，得濃縮物，加濃縮物重量10倍的蒸饋水混懸，得混懸液，加入混懸 液等體積的乙酸乙醋萃取3次，合并乙酸乙醋萃取層，減壓回收溶劑，得到乙酸乙醋萃取部 位的浸膏