植物耐逆性相關轉錄因子及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及植物基因工程領域，具體設及植物耐逆性相關轉錄因子及其編碼基因 與應用。
【背景技術】
[0002] 干旱脅迫和鹽脅迫是農(nóng)作物生長和產(chǎn)量的重要限制因素。干旱脅迫和鹽脅迫引起 的缺水嚴重抑制了葉片細胞膨脹、擴展，從而影響了葉片生長和地上部分的正常發(fā)育，最終 限制了植物開花結果。木本植物因其多年生的不可移動性，耐逆機理研究和耐逆品種選育 尤為重要。
[000引同源框化omeobox)是指編碼60個保守的氨基酸同源異型結構域 化omeodomain，皿）。60個氨基酸折疊為Ξ螺旋結構，與DNA特異性的結合。同源框普遍存 在于植物、動物W及人、果蛹等中，包括6個家族皿-Zip,KN0X，P皿，BHi^，W0X和ZF-HD，其 中家族皿-Zip(Homeodomain-leucinezipper)是植物特異轉錄因子。皿-Zip轉錄因子包 括4個亞家族，其成員參與調控正常生長條件和環(huán)境脅迫后植物的生長發(fā)育。Pb皿12屬于 皿-Zip亞家族I成員之一。
[0004] 杜梨（Pyrusbetulae化liaBunge)原產(chǎn)中國，其適應性強，具備耐寒、耐旱、耐潰、 耐鹽等優(yōu)良特性，與品種親和力高，嫁接后可W提高品種抗逆抗病蟲害。但是由于缺乏對 梨化木抗逆機理系統(tǒng)的理論研究，造成了至今無法充分開發(fā)利用該化木選育出優(yōu)良抗逆株 系。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種植物耐逆性相關轉錄因子及其編碼基因。
[0006] 本發(fā)明的另一一目的是提供含有所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或 重組菌。
[0007] 本發(fā)明的再一目的是提供一種培育轉基因植物的方法。
[0008] 本發(fā)明的目的采用如下技術方案實現(xiàn)。
[0009] 植物耐逆性相關轉錄因子，是如下1)或2)的蛋白質：
[0010] (1)由SEQIDNO:2所示氨基酸序列組成的蛋白質；
[0011] (2)將SEQIDNO:2所示氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的缺失或添加且 與植物耐逆性狀相關的由（1)衍生的蛋白質。
[0012] 本發(fā)明還提供所述植物耐逆性相關轉錄因子的編碼基因。
[0013] 在本發(fā)明中，所述植物耐逆性相關轉錄因子的編碼基因為如下（1)-(2)中任一所 述基因：
[0014] (1)SEQIDNO:1所示序列自5'端的第77-772位核巧酸；
[001引 （2)沈QIDNO:1所示序列。
[0016] 本發(fā)明還提供含有所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
[0017] 在本發(fā)明中，所述重組載體是在載體祀T-22b(+)中插入權利要求2或3所述基因 后得到的重組載體；或者是在載體PCAMBIA2301中插入權利要求2或3所述基因后得到的 重組載體。
[0018] 本發(fā)明還提供所述杜梨耐逆性相關轉錄因子或所述編碼基因在培育耐逆植物中 的應用；所述耐逆性為耐旱性、耐鹽性。
[0019] 本發(fā)明還提供一種培育轉基因植物的方法，是將所述的編碼基因導入目的植物 中，得到具有耐逆性的轉基因植物。
[0020] 在本發(fā)明中，所述編碼基因插入載體PCAMBIA2301中，然后導入目的植物中。
[0021] 在本發(fā)明中，所述目的植物為水稻、番茄、楊樹、蘋果、擬南芥、煙草或首猜。
[0022] 在本發(fā)明中，所述耐逆性為耐鹽性和/或耐旱性。
[0023] 攜帶有編碼基因的表達載體可通過使用Ti質粒、化質粒、植物病毒載體、直接DNA 轉化、顯微注射、電導、農(nóng)桿菌介導等生物學方法轉化細胞或組織，并將轉化的植物組織培 育成植株。被轉化的植物宿主包括梨、水稻、擬南芥、蘋果、番茄、楊樹、首猜等。
[0024] 將本發(fā)明的化皿12基因轉入番茄的實驗可證明：在鹽脅迫和干旱脅迫實驗中，T2 代的3個轉化皿12基因植株，存活率、含水量和葉綠素含量顯著好于野生植株。說明本發(fā) 明提供的化皿12基因與其編碼的蛋白能夠顯著提高植物的耐鹽耐干旱能力。對培育耐非 生物脅迫植物品種具有重要的理論及實際意義，可用于耐逆植物品種的培育和鑒定。
【附圖說明】
[002引 圖1半定量RT-PCR分析Pb皿12基因在杜梨不同組織中的表達情況；在圖的左邊 標出了各膠條分析的基因名稱，Pb皿12為目的基因，Actin為內參基因；各泳道上方標出了 樣品來源，Root:根，Leaf:葉，Stem:莖，F(xiàn)lower:花，Rruit:果實。
[0026] 圖2巧光定量RT-PCR和半定量RT-PCR分析在干旱、高鹽脅迫處理不同時間， Pb皿12基因表達特征，其中A是巧光定量RT-PCR分析化C1或陽G6000脅迫處理后，Pb皿12 基因在杜梨葉子中表達時序；B是半定量RT-PCR分析化C1或陽G6000脅迫處理后，Pb皿12 基因在杜梨葉子和根中基因表達情況。B中左邊標出了各膠條分析的基因，化皿12為目的 基因，Actin為內參基因；右邊標出了各膠條中樣品的脅迫處理條件；圖上方標出了各列膠 條中樣品來源，Leaves表示葉子，Roots表示根；圖中各泳道上方標出了樣品經(jīng)脅迫處理的 時間。
[0027] 圖3是重組菌化21-pET-22b(+)和化21-pET-22b(+)-Pb皿12無脅迫、在高鹽和模 擬干旱（l〇%PEG6000)脅迫中的生長曲線，其中A表示無脅迫條件下，B表示高鹽條件脅迫 下，C表示模擬干旱脅迫條件下。
[0028] 圖4半定量RT-PCR分析各培養(yǎng)條件下重組菌化2l-pET-2化(+)(對照菌） 和化21-pET-22b(+)-Pb皿12中Pb皿12基因表達情況（qRT-PCR分析），其中A表 示各重組菌在無脅迫條件下IPTG誘導對化皿12基因表達情況影響，B表示重組菌 化21-PET-2化(+)-Pb皿12在脅迫條件下化皿12基因表達情況。圖的左側標出了各膠條分 析的基因，化皿12為目的基因，16SrDNA為內參基因。圖的右側標出了各膠條中各樣品處理 條件。
[0029] 圖5各純合轉基因株系RT-PCR檢測和半定量RT-PCR檢測電泳圖，圖A表示 pMD18-Pb皿12質粒DM、WT(野生植株）、PIA、P2B、P5B的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖；圖B表示W(wǎng)T(野生植株）、P1A、P2B、P5B的Pb皿12基因的表達情況（半定量RT-PCR)，Actin為內參 基因。
[0030] 圖6高鹽處理和干旱脅迫處理后，轉P地B12基因番茄和野生植株的存活率比較， 其中A為干旱脅迫處理，B為高鹽脅迫處理，WT表示野生植株，P1A、P2B、P5B表示轉化皿12 基因番茄植株。
[0031] 圖7高鹽處理和干旱脅迫處理后，轉化皿12基因番茄和野生植株葉綠素含量比 較，其中A為高鹽脅迫處理，B為干旱脅迫處理，WT表示野生植株，P1A、P2B、P5B表示轉 化皿12基因番茄植株。CK表示非生物脅迫條件培養(yǎng)對照。
[003引圖8高鹽處理和干旱脅迫處理后，轉P地B12基因番茄和野生植株的含水量比較， 其中A為高鹽脅迫處理，B為干旱脅迫處理，WT表示野生植株，P1A、P2B、P5B表示轉化皿12 基因番茄植株，CK表示非生物脅迫條件培養(yǎng)對照。
【具體實施方式】
[0033] 實施例1杜梨耐逆性相關轉錄因子化皿12編碼基因化皿12基因的篩選及其cDNA 克隆
[0034]W擬南芥AT皿7(NM_130233.4)為探針，進行NCBI同源比對，根據(jù)蘋果Malus X domestica類Μ地B7(HM122586. 1)和Μ地BieOM!22573. 1)序列，設計引物對（上游引物 化皿12_F1和下游引物化皿12_F2)用于從杜梨中擴增耐逆性相關轉錄因子化皿12基因。
[0035] 采用150mM化C1水溶液處理杜梨生根苗，24h后剪取杜梨葉片，W常規(guī)方法提取 脅迫處理后的杜梨葉片總RNA。采用cDNA第一鏈合成試劑盒（M-MuLVFirstStrandcDNA SynthesisKit,上海生工生物工程有限公司）合成cDNA第一鏈，然后WcDNA為模板，采用 上游引物化皿12_F1和下游引物化皿12_F2W及接頭引物對（OUT邸和INNER)進行巢式 PCR。
[0036]Pb皿 12-F1 (沈QIDNO:3)序列：5,-ATTGTTCATCTATTGTTGAGAGCAT-3' -3';
[0037]Pb皿 12_F2(沈QIDNO:4)序列：5' -CACATTCACTTAAAAATTAATACTT-3'。
[0038]OUTER(沈QIDNO:5)序列：5, -GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC-3';
[0039]INNER(沈QIDNO:6)序列：5, -GCTACGTAACGGCATGACAGTG-3'。
[0040] 巢式PCR反應體系為：
[0041]
[0042]

[0043] 巢式PCR反應程序為：
[0044]
[004引對巢式PCR產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為lOOObp的條帶， 與預期結果相符。用PCR產(chǎn)物回收試劑盒燈aKaRaMiniBESTDNA化a卵entPurification KitVer4.0,寶生物工程（大連）有限公司），回收PCR產(chǎn)物。將該PCR產(chǎn)物插入質粒 p-MD18(寶生物工程（大連）有限公司）得到重組質粒p-MD18-Pb皿12。將重組質粒 p-MD18-Pb皿12轉化大腸桿菌D冊a感受態(tài)細胞（寶生物工程（大連）有限公司），用氨節(jié)青 霉素（Amp)標記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質粒送去測序。測序表明PCR產(chǎn) 物由1029bp堿基組成，序列如SEQIDNO:1所示。將該PC