一株枯草芽孢桿菌及包含該菌株的飼料添加劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及功能微生物篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株枯草芽抱桿菌及包含該菌株 的飼料添加劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著水產(chǎn)品需求量的增加及水產(chǎn)品貿(mào)易的國際化發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)近年來發(fā)展突 飛猛進(jìn)。但是，水產(chǎn)養(yǎng)殖的集約化和高密度規(guī)模日益擴(kuò)大，養(yǎng)殖環(huán)境的惡化和疾病的危害給 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)防治疾病的方法主要是使用抗生素，抗生素使用 易產(chǎn)生耐藥性菌株問題，并且存在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)殘留的問題，因此尋找抗生素替代品成為 必然。
[0003] 益生菌能夠參與動(dòng)物體內(nèi)微生物平衡，直接通過增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)腸內(nèi)有害微生物群落 的抑制作用，或通過增強(qiáng)非特異性免疫功能來預(yù)防疾病，進(jìn)而間接起到促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作 用，提高動(dòng)物飼料的轉(zhuǎn)化率。因此，近些年對(duì)于益生菌的篩選成為本領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)，也 對(duì)水產(chǎn)飼料配方的改進(jìn)具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株新型枯草芽抱桿菌及包含該菌株的水產(chǎn)飼料添加劑。所 述枯草芽抱桿菌度acillussubtillis)篩選自南美白對(duì)郵養(yǎng)殖池，能夠有效抑制病原菌， 提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力和抗病力，促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)，應(yīng)用前景廣泛。
[0005] 本發(fā)明一方面提供了一株枯草芽抱桿菌SY12度acillussubtillisSY12)，已 于2015年8月10日保藏于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，其保藏編號(hào)為 CCTCCNO:12015483ο
[0006] 本發(fā)明另一方面提供了包含上述枯草芽抱桿菌的飼料添加劑。
[0007] 所述飼料添加劑還包括多糖、維生素、中草藥、酶或乳化劑中的一種或多種的組 么 η〇
[0008] 本發(fā)明還提供了上述枯草芽抱桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用。 陽009] 本發(fā)明的有益效果：
[0010] 本發(fā)明篩選到的枯草芽抱桿菌SY12,能有效抑制哈維弧菌和媛弧菌等病原菌，提 高養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫力，減少病害的發(fā)生，同時(shí)該菌株產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶的能力均較強(qiáng)，可作 為飼料添加劑，顯著提高養(yǎng)殖動(dòng)物的消化能力和對(duì)飼料的利用率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。
[0011] 所述枯草芽抱桿菌SY12可作為益生菌應(yīng)用于草魚和南美白對(duì)郵的養(yǎng)殖生產(chǎn)中。 與對(duì)照組相比，飼喂本發(fā)明所述枯草芽抱桿菌SY12的實(shí)驗(yàn)組草魚的增重率提高了 26. 8% ; 且實(shí)驗(yàn)組草魚血清中溶菌酶、堿性憐酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的酶活分別提高了 4. 1%、10. 5%、3. 9%、80. 4% ;實(shí)驗(yàn)組草魚消化道中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性分別提 高了 23. 2%、70. 1%、6. 2%。；飼喂包含枯草芽抱桿菌SY12的復(fù)合添加劑的實(shí)驗(yàn)組中南美 白對(duì)郵的增重率和特定生長(zhǎng)率分別提高了 17. 3%和9.4% ;且實(shí)驗(yàn)組對(duì)郵血液中血細(xì)胞數(shù) 和呼吸爆發(fā)活力分別提高了 38. 4%和14. 7% ;實(shí)驗(yàn)組對(duì)郵血清中酪氧化酶、超氧化物歧化 酶和一氧化氮合酶的酶活力分別提高了 42. 9%、3. 8%和21. 4%;實(shí)驗(yàn)組對(duì)郵消化道中蛋白 酶和淀粉酶的酶活力分別提高了 62. 5%和71. 8%，均取得了顯著的技術(shù)效果。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 實(shí)施例1菌株的分離、篩選與鑒定 [001引1、樣品
[0014] 采集于青島市膠州南美白對(duì)郵養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖池水樣。 陽01引 2、培養(yǎng)基：
[0016] D2216E海水培養(yǎng)基：蛋白陳5g，酵母浸出物Ig，憐酸鐵O.Olg，海水1000ml， 抑7. 6-7. 8,配制固體培養(yǎng)基加入15-20g的瓊脂，121°C滅菌20min。 陽017] 2)TSB培養(yǎng)基：膜蛋白腺大豆肉湯30g，氯化鋼15g，蒸饋水1000ml，pH7. 4-7. 6,配 制固體培養(yǎng)基加入15-20g的瓊脂，121°C滅菌20min。 陽0化]扣MRS培養(yǎng)基：蛋白腺lOg，牛肉膏l(xiāng)Og，葡萄糖20g，酵母粉5g，吐溫-801ml，憐酸二氨鐘2g，巧樣酸二錠2g，乙酸鋼5g，硫酸儀0. 58g，硫酸儘0. 15g，蒸饋水1000ml， P冊(cè).2-6. 4,加入15-20g的瓊脂W配制固體培養(yǎng)基，115°C滅菌20min。
[0019] 4)淀粉水解培養(yǎng)基：蛋白腺lOg，牛肉膏5g，氯化鋼5g，可溶性淀粉2g，蒸饋水 1000ml，pH7. 4-7. 6,115Γ滅菌 20min。
[0020] 5)酪素水解培養(yǎng)基：溶液A:酵母膏3g、蛋白腺lOg、瓊脂lOg、海水1000ml;溶液 B:酪蛋白lOg、蒸饋水250ml;溶液C:瓊脂lOg、蒸饋水250ml;分別將立種溶液m°C滅菌 20min，冷卻后先將B液和C液混合，倒入平板形成一薄層，待薄層凝固后倒入A液，制成雙 層平板。
[0021] 3、篩選方法
[0022] 取1ml水樣，用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋，分別接種于2216E、TSB和MRS固體 培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2地-4她。選取均勻清晰的單菌落，劃線純化細(xì)菌。單菌落依此命名為SY1、SY2、SY3......、SY16。
[0023] W致病菌一一哈維弧菌和媛弧菌為指示菌，采用平板括抗法篩選益生菌。在涂有 指示菌的平板上點(diǎn)種待篩選的細(xì)菌菌液，28°C恒溫培養(yǎng)，4化內(nèi)觀察點(diǎn)種區(qū)周圍是否出現(xiàn)抑 菌透明區(qū)或覆蓋區(qū)。對(duì)病原菌的抑制作用表示為抑菌圈直徑與菌落直徑的比值，1則沒有抑 制作用，1-2表示具有一定的抑制作用，〉2表示抑菌作用較強(qiáng)。具體結(jié)果見表1
[0024] 表1潛在益生菌株抑菌情況 陽0巧]
[00%] 從表1的數(shù)據(jù)可W看出，本發(fā)明篩選到的菌株中只有5株菌對(duì)哈維弧菌和媛弧菌 均具有一定的抑制作用，其中W菌株SY12的抑菌能力最強(qiáng)。
[0027] 將篩選出的SY1、SY2、SY5、SY8和SY12運(yùn)5株病原菌括抗菌分別點(diǎn)種于淀粉水解 培養(yǎng)基和酵素水解培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)4化形成明顯菌落后觀察有無透明水解圈。產(chǎn) 酶能力表示為透明圈直徑與菌落直徑的比值，1表示不產(chǎn)生酶，1-2表示產(chǎn)酶能力一般，〉2 表示產(chǎn)酶能力較強(qiáng)。具體結(jié)果見表2 陽〇 2引表2潛在益生菌株產(chǎn)酶能力
[0029]
[0030] 從表2的數(shù)據(jù)可W看出，本發(fā)明篩選到的5株病原菌括抗菌中只有SY8和SY12產(chǎn) 蛋白酶和淀粉酶的能力均較強(qiáng)，而其中又WSY12菌株的綜合產(chǎn)酶能力最強(qiáng)。
[0031] 4、菌株鑒定
[0032] 1)菌落形態(tài)特征：將上述菌株SY12重新劃線培養(yǎng)，其菌落呈現(xiàn)為扁平狀，灰白色， 不透明，邊緣銀齒狀。 陽03引 2)提取上述菌株SY12的基因組