一種重組生產(chǎn)克氏原螯蝦atp合酶f0亞基6蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高表達克氏原螯蝦ATP合酶F0亞基6的基因工程菌，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]“眼柄切除誘導(dǎo)蝦蟹類甲殼動物卵巢快速發(fā)育成熟”(簡稱蝦蟹卵巢“眼柄切除效應(yīng)”)存在相似的分子機制，闡明分子機制具有重要科學(xué)意義和應(yīng)用前景。如何實現(xiàn)無/弱副作用的人工卵巢發(fā)育調(diào)控一直是經(jīng)濟蝦蟹養(yǎng)殖的重要難題之一。目前人們雖已摸索出不少促蝦蟹卵巢快速成熟方法，如控溫、控光、強化營養(yǎng)條件、激素處理等，但眼柄切除仍是不少蝦蟹人工育苗生產(chǎn)中促進親蝦卵巢快速成熟及產(chǎn)卵的最常用、最有效方法。目前在蝦蟹繁殖季節(jié)，人工切除雌性蝦蟹的單側(cè)眼柄用以促進卵巢同步發(fā)育、快速成熟，提高抱卵量，已在不少國家較為普遍應(yīng)用于多種海洋和淡水經(jīng)濟蝦蟹(如斑節(jié)對蝦、大西洋龍蝦、鋸緣青蟹等)的規(guī)?；B(yǎng)殖中。然而，應(yīng)用實踐中會出現(xiàn)無法避免的副作用:切除眼柄后易致親體蛻皮周期縮短、死亡率上升、卵子質(zhì)量下降等不良后果。蝦蟹卵巢“眼柄切除效應(yīng)”存在相似的分子機制，深入闡明該分子機制將非常有助于發(fā)掘到新的、更合理的人工生殖調(diào)控分子靶點，從而指導(dǎo)發(fā)展可替代眼柄切除、無/弱副作用的人工卵巢促熟思路和方法，對于經(jīng)濟4下蟹類人工養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要價值?？耸显?下(Procambarus clarkii)，俗稱龍蝦、小龍蝦，隸屬節(jié)肢動物門、甲殼綱、十足目，是具較高經(jīng)濟價值的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一；同時，克氏原螯蝦還具有成本低、易飼養(yǎng)、體型較大易于實驗操作等優(yōu)點，因此是研究蝦蟹類卵巢“眼柄切除效應(yīng)”分子機制的一種非常好的代表動物。
[0003]ATP合酶F0是線粒體內(nèi)膜上電子傳遞鏈的組成部分，是一個嵌合在膜上的疏水蛋白復(fù)合體，形成一個跨膜質(zhì)子通道，參與細(xì)胞能量代謝。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)ATP合酶F0在克氏原螯蝦眼柄切除后的中期及晚期表達水平均逐漸提高，至卵巢發(fā)育至成熟期時(?15day)表達水平達到最高，與卵巢成熟標(biāo)志物vitellogenin動態(tài)表達模式類似，表明其在克氏原螯蝦“眼柄切除效應(yīng)”過程中具有重要功能。為深入探究ATP合酶F0在克氏原螯蝦“眼柄切除效應(yīng)”誘導(dǎo)卵巢快速發(fā)育成熟中的作用和調(diào)控模式，首先需要制備大量高活性的ATP合酶F0蛋白，并用以制備多/單克隆抗體。本專利使用大腸桿菌重組表達系統(tǒng)，構(gòu)建高表達克氏原螯蝦ATP合酶F0亞基6蛋白的基因工程菌，為后續(xù)深入研究克氏原螯蝦卵巢“眼柄切除效應(yīng)”的分子機制奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高表達克氏原螯蝦ATP合酶F0亞基6的基因工程菌，是將基因atp6導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)得到的基因工程菌。
[0005]所述基因atp6的序列是根據(jù)GeneBank中來源于克氏原螯4下(Procambarusclarkii)的Sequence ID:AFQ31581的序列進行全基因化學(xué)合成得到。
[0006]本發(fā)明的第二個目的在于提供上述基因工程菌的構(gòu)建方法，成功過表達獲得了克氏原螯4下ATP合酶FO亞基6蛋白，其步驟如下:
[0007](1)設(shè)計引物 atp6-l: (5 ' ~TCAGGAGGTACCATGATAACAAGATTATTTAGA~3 ')和atp6-2: (5' -ACTGAGAAGCTTTTAATTTACTTCTCTAGCATATAAAG-3')，利用 PCR 將克氏原螯蝦ATP合酶R)亞基6基因的cDNA編碼框5’和3’兩側(cè)分別引入Κρη I和Hind I II限制性酶切位點(下劃線顯示)；
[0008](2)通過雙酶切、分子連接等基因操作將atp6基因插入到表達質(zhì)粒pColdll，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pColdII_atp6 ；
[0009](3)隨后將pColdI1-atp6轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)，通過氨芐抗生素平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子并進行測序驗證。
[0010]本發(fā)明選取大腸桿菌冷休克表達載體pColdll，構(gòu)建了重組表達載體pColdI1-atp6，利用大腸桿菌系統(tǒng)成功高可溶性表達獲得了克氏原螯蝦ATP合酶F0亞基6蛋白，并對表達的ATP合酶F0亞基6蛋白進行了純化及免疫印跡分析。
[0011]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果:本發(fā)明首次以大腸桿菌為表達宿主實現(xiàn)了克氏原螯蝦ATP合酶R)亞基6的高效重組表達，重組表達的可溶性ATP合酶R)亞基6蛋白的表達量約占表達株BL21(DE3)菌體總蛋白量的42%，大部分為可溶性狀態(tài)，目前國際上尚未見任何有關(guān)重組表達克氏原螯蝦ATP合酶F0亞基6蛋白的報道。
【具體實施方式】
[0012]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。
[0013]下面結(jié)合具體的制備實施例和應(yīng)用實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0014]在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[0015]實施例1克氏原螯蝦atp6基因的獲得
[0016]根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已公開的克氏原螯4下atp6基因(Sequence ID:AFQ31581)序列進行全基因化學(xué)合成。
[0017]實施例2克氏原螯蝦ATP合酶F0亞基6的大腸桿菌重組表達、純化及免疫印跡鑒定
[0018]設(shè)計引物atp6-l:(5, ~TCAGGAGGTACCATGATAACAAGATTATTTAGA~3r )和 atp6_2:(5 ' -ACTGAGAAGCTTTTAATTTACTTCTCTAGCATATAAAG-3 ')，利用 PCR 將克氏原螯蝦 ATP 合酶即亞基6基因的cDNA編碼框5’和3’兩側(cè)分別引入Κρη I和Hind I II限制性酶切位點(下劃線顯示)，通過雙酶切、分子連接等基因操作將atp6基因插入到商業(yè)化表達質(zhì)粒pColdll，構(gòu)建重組質(zhì)粒pColdI1-atp6。隨后將pColdI1-atp6轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)，通過氨芐抗生素平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子并進行測序驗證，隨后利用IPTG進行重組NADH脫氫酶亞基III蛋白的誘導(dǎo)表達。培養(yǎng)基成分為:胰蛋白胨(TryptoneUOg/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L，氯化鈉(NaCl) 10g/L，pH 7.4。
[0019]誘導(dǎo)表達條件為:將重組表達質(zhì)粒pColdI1-atp6轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)。含重組質(zhì)粒的工程菌在37°C條件下劇烈震蕩培養(yǎng)至0D6。。?0.5，隨后轉(zhuǎn)入15°C培養(yǎng)并加入終濃度為0.2mM的IPTG，誘導(dǎo)表達20h，轉(zhuǎn)速180rpm。收集菌體，SDS-PAGE分析全菌總蛋白顯示，基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)后有明顯的特異表達條帶，條帶分子量與預(yù)期大小分子量?25kD —致。在此條件下，重組蛋白的表達量約占菌體總蛋白量的42%，大部分為可溶性狀態(tài)。誘導(dǎo)表達后，超聲破碎菌體，利用Ni+柱親和層析法純化得到可溶性ATP合酶F0亞基6，咪唑洗脫濃度為450mM。進一步利用免疫印跡法對重組ATP合酶F0亞基6進行表達鑒定分析。上述相關(guān)方法均采用常規(guī)操作步驟。
[0020]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1.一種高效表達克氏原螯蝦ATP合酶F0亞基6蛋白的基因工程菌，是將atp6基因?qū)隕.coli BL21(DE3)得到的基因工程菌。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述atp6基因的核苷酸序列如GeneBank 中 Sequence ID:AFQ31581 的序列所不。3.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述基因工程菌的方法，其步驟如下:(1)設(shè)計引物atp6-l: (5' ~TCAGGAGGTACCATGATAACAAGATTATTTAGA~3/ )和 atp6_2:(5' -ACTGAGAAGCTTTTAATTTACTTCTCTAGCATATAAAG-3')，利用 PCR 將克氏原螯蝦 ATP 合酶F0亞基6基因的cDNA編碼框5’和3’兩側(cè)分別引入Κρη I和Hind I II限制性酶切位占.(2)通過雙酶切、分子連接等基因操作將atp6基因插入到表達質(zhì)粒pCo1 dll，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pColdII_atp6 ； (3)隨后將pColdI1-atp6轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)，通過氨芐抗生素平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子并進行測序驗證； 所述限制性酶切位點以加下劃線的字母表示。4.一種以權(quán)利要求1所述基因工程菌生產(chǎn)ATP合酶R)亞基6蛋白的方法，其步驟如下:將重組表達質(zhì)粒pColdI1-atp6轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。含重組質(zhì)粒的工程菌在37°C條件下劇烈震蕩培養(yǎng)至0D6。。?0.5，隨后轉(zhuǎn)入15°C培養(yǎng)并加入終濃度為0.2mM的IPTG，誘導(dǎo)表達20h，轉(zhuǎn)速180rpm。收集菌體，SDS-PAGE分析全菌總蛋白顯示，基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)后有明顯的特異表達條帶，條帶分子量與預(yù)期大小分子量?25kD —致。在此條件下，重組ATP合酶R)亞基6蛋白的表達量約占菌體總蛋白量的42 %，大部分為可溶性狀態(tài)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組生產(chǎn)克氏原螯蝦ATP合酶F0亞基6蛋白的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過全基因合成獲得atp6基因，構(gòu)建重組表達載體pColdII-atp6并轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)實現(xiàn)高效表達，為后續(xù)針對克氏原螯蝦卵巢“眼柄切除效應(yīng)”分子機制的深入研究奠定了重要基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N15/70, C12N1/21, C12N9/14, C12R1/19
【公開號】CN105368765
【申請?zhí)枴緾N201510665983
【發(fā)明人】水燕, 周鑫, 徐增洪, 沈懷舜, 陳麗薇
【申請人】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年10月15日