一種Ⅰ群4型禽腺病毒毒株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物病毒篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種I群4型禽腺病毒毒株及其 應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] I群禽腺病毒組成了腺病毒科的禽腺病毒屬。II群（火雞出血性腸炎和相關(guān)病 毒）和III群（減蛋綜合征）腺病毒與疾病的關(guān)系明確，相比之下，大多數(shù)I群的禽腺病毒對 禽類的致病作用還未完全確定。但FAdV-1和FAdV-4明顯屬于例外，其中FAdV-1能引起鶴 譜支氣管炎，F(xiàn)AdV-4是屯、包積水肝炎綜合征的主要病因。當(dāng)雞的健康受到損害時，如并發(fā) 感染雞傳染性貧血病毒（CIAV)和傳染性法氏囊病病毒（IBDV)等其他病原，其他的腺病毒 毒株可使條件性致病原發(fā)生快速感染。I群禽腺病毒已鑒定了 5個禽腺病毒，其名稱用字 母A~E表示。每個種內(nèi)的病毒主要根據(jù)交叉中和實驗結(jié)果進一步分為不同的血清型。病 毒顆粒直徑為70~90nm，無囊膜，呈20面體對稱結(jié)構(gòu)。病毒核酸為雙股DNA，占整個病毒 粒子的11. 3%~13. 5%，其余部分為蛋白質(zhì)。病毒六鄰體是主要的衣殼蛋白，含有型、群和 群特異性抗原決定簇，因而感染后可產(chǎn)生相應(yīng)的型、群和群的特異性抗體。
[0003] I群禽腺病毒呈世界性分布，各年齡段家禽均易感?？蒞通過水平和垂直兩種途 徑傳播。雖然感染雞的12個血清型之間及血清型內(nèi)部的毒力各有不同，但12個血清型均 能誘發(fā)包涵體肝炎（IBH)。FAdV-4引起的屯、包積水肝炎綜合征化服）的主要臨床癥狀為 產(chǎn)蛋下降和引起死亡（死亡率在20 %~80 % )，主要病理變化是屯、包腔中有淡黃色清亮的 積液，肝臟腫大、蒼白，腎臟腫大，屯、臟和肝臟出現(xiàn)多發(fā)性局灶性壞死，肝細(xì)胞中見核內(nèi)包涵 體。1987年，己基斯坦首次發(fā)現(xiàn)屯、包積水肝炎綜合征化服），不到一年，皿S就摧毀了己基 斯坦的家禽養(yǎng)殖業(yè)。之后在印度、科威特、伊朗、日本和前蘇聯(lián)也發(fā)現(xiàn)該病。如今，世界各地 都有皿S的蹤影，遍及拉下美洲-中東和亞洲的一些國家。
[0004] 通過對I群禽腺病毒的流行病學(xué)調(diào)查，該病在我國雞群中發(fā)病率較高，且呈逐年 上升趨勢。發(fā)病的宿主范圍越來越廣，白羽肉雞、肉種雞、蛋雞、黃羽雞均可感染發(fā)病。特別 是2010年W后發(fā)病呈現(xiàn)增加趨勢，在全國范圍內(nèi)均有流行。臨床表現(xiàn)包涵體肝炎（IBH)、屯、 包積水肝炎綜合征（H服）。隨著我國養(yǎng)雞業(yè)的迅速發(fā)展，I群禽腺病毒的發(fā)病率給飼養(yǎng)業(yè)造 成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。關(guān)于該病的防治，國外已有預(yù)防I群禽腺病毒的商品化疫苗，至今國 內(nèi)尚無疫苗可用，導(dǎo)致I群禽腺病毒防控存在漏桐。篩選分離出合適的有效疫苗毒株，W使 國內(nèi)I群禽腺病毒的防控更具有針對性和有效性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種I群4型禽腺病毒毒株，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006] 本發(fā)明提供的一株I群4型禽腺病毒YBAV-4株，于2015年10月15日保藏在位 于武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏編號為：CCTCCNo.V201541。
[0007] 本發(fā)明病毒株用于制備疫苗；優(yōu)選為滅活疫苗；
[0008] 本發(fā)明的病毒毒株YBAV-4株還用于制備I群4型禽腺病毒檢測用的瓊擴抗原試 劑。
[0009] 本發(fā)明的病毒毒株YBAV-4株還用于制備I群4型禽腺病毒檢測用陽性血清試劑。
[0010] 本發(fā)明的病毒毒株YBAV-4株還用于制備I群4型禽腺病毒治療用抗血清試劑。
[0011] 本發(fā)明的I群4型禽腺病毒YBAV-4株具有良好的特異性和免疫原性，感染細(xì)胞液 與抗減蛋綜合征病毒、雞傳染性法氏囊病毒、新城疫病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、雞馬立 克氏病病毒、禽流感等特異性陽性血清雞SPF雞血清均不出現(xiàn)特異性沉淀線，而能與抗I 群4型禽腺病毒特異性血清出現(xiàn)明顯的特異性沉淀線。本發(fā)明作為制造效果良好的疫苗毒 株，預(yù)防雞屯、包積水肝炎綜合征，用于病毒血清型的鑒定和流行病學(xué)的調(diào)查。
【附圖說明】
[001引 圖1 :分離毒株P(guān)CR鑒定結(jié)果，其中泳道1 :DL2000Marker;2 :陰性對照；3 :陽性對 照；4 :本發(fā)明的分離毒；
[0013] 圖2:分離毒與其他禽腺病毒毒株的Hexon基因同源性性比較；
[0014] 圖3 :分離毒株化χοη基因遺傳進化樹分析；
【具體實施方式】
[0015]W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0016] 若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。 SPF種蛋和維雞購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。I群禽腺病毒1型CVCC AV208 株、2 型CVCCAV209 株、3 型CVCCAV210 株、4 型CVCCAV211 株、5 型CVCCAV212 株、6 型CVCCAV213 株、7 型CVCCAV214 株、8 型CVCCAV215 株、9 型CVCCAV216 株、10 型 CVCCAV217株、11型CVCCAV218株和12型CVCCAV219株標(biāo)準(zhǔn)毒株均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān) 察所；III群禽腺病毒邸SV-76京911株，公司質(zhì)量管理部種毒組領(lǐng)用。12個血清型（Avian AdenovirusType1~ISAntiserum)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清購自Qiarlesliiver，作為參考陽性血 清；標(biāo)準(zhǔn)陽性、陰性血清由本實驗室制備。
[0017] 實施例1 :I群4型禽腺病毒YBAV-4株的分離與鑒定
[0018] 1、流行病學(xué)調(diào)查自2010年W來，山東、江蘇等地區(qū)的部分肉種雞、蛋雞及麻雞出 現(xiàn)了一種W死亡率高，解剖主要表現(xiàn)為肝臟腫大、屯、包積水為特點的疾病，經(jīng)臨床調(diào)查和實 驗室檢測，初步診斷為I群C-4型禽腺病毒引起的屯、包積水肝炎綜合征。2010年，發(fā)明人從 山東溜博某養(yǎng)殖場有包涵體肝炎和屯、包積水典型癥狀的病死雞肝臟中成功分離到1株病 〇
[0019]2、病毒分離取病死雞的肝臟研碎后，用按1:5的比例加入滅菌生理鹽水制成懸 液；反復(fù)凍融3次后，30(K)r/min離屯、30min，取上清；加入青霉素和鏈霉素各lOOOOIU/ml， 4°C過夜，經(jīng)微孔濾器過濾，無菌檢驗合格后保存?zhèn)溆谩⑸鲜鲋苽涞牟《疽篧0. 2ml/胚的 劑量，經(jīng)卵黃囊途徑接種6. 5日齡SPF雞胚，棄24h內(nèi)死胚，取接種4化~16化內(nèi)死亡雞 胚的尿囊液和胎兒，用上述方法處理后連續(xù)傳代，觀察第3代死胚的肝組織，雞胚表現(xiàn)為死 胚、胚體矮小、發(fā)育遲緩、胎兒卷曲、肝臟腫大和質(zhì)脆，胚胎充血。收集死胚尿囊液和胎兒，一 20°C保存。
[0020] 3、病毒的鑒定
[0021] 3. 1血凝特性鑒定無菌采集SPF雞和鴨血液5~10ml，反復(fù)洗3~5次，末次用生 理鹽水將血細(xì)胞泥稀釋成0. 8%、1%和2%濃度，4°C保存?zhèn)溆?。按常?guī)方法檢測分離毒株 是否具有凝集運些紅細(xì)胞的特性。同時設(shè)III群禽腺病毒邸SV-76為凝集反應(yīng)陽性對照。結(jié) 果：分離毒不能凝集SPF雞和鴨紅細(xì)胞，即使改變紅細(xì)胞的濃度，也不能使之凝集。III群禽 腺病毒邸SV-76能夠凝集雞、鴨的紅細(xì)胞。
[0022] 3. 2理化特性檢驗參照《動物病毒學(xué)》介紹的方法，病毒液分別W5-漠尿喀 晚-2'-脫氧核巧度UDR)、氯仿、乙酸、鹽酸加3)、氨氧化鋼加10)、溫度（60°C、lh)處理 后，接種雞胚化2ml/胚），另設(shè)生理鹽水處理組作為對照。接種5d后觀察雞胚病變。結(jié) 果：分離毒分別經(jīng)腳DR、氨氧化鋼加10)和60°C、lh處理后，接種雞胚，雞胚表現(xiàn)正常，PCR 檢測陰性。表明腳DR能抑制病毒在雞胚中的復(fù)制，分離毒株的核酸類型為DNA，病毒不耐 堿，對熱敏感，60°C，lh可被滅活。而經(jīng)乙酸、氯仿和鹽酸（P冊）處理的毒株，不影響病毒在 雞胚中的增殖，出現(xiàn)明顯的雞胚病變，PCR檢測結(jié)果陽性。表明病毒沒有脂質(zhì)囊膜，對乙酸 和氯仿有抵抗力，耐酸。
[002引 3. 3血清學(xué)鑒定
[0024] 3. 3. 1群特異性鑒定利用瓊脂凝膠擴散試驗（AG巧制備瓊脂凝膠平板對分離毒株 進行群特異性鑒定。瓊脂凝固后，用打孔器打孔，打孔圖案為中央1孔四周6孔，孔徑4mm， 孔距為4mm，孔底封閉。待檢病毒置于中間孔，周圍孔加I群禽腺病毒標(biāo)準(zhǔn)株、EDSV-76京 911株標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及陰性血清。將瓊擴板放置于加蓋濕盒中37°C作用，24~4化觀察是 否出現(xiàn)凝集沉淀線。結(jié)果：分離毒抗原僅能與I群禽腺病毒4型陽性血清出現(xiàn)明顯沉淀線， 而與III群禽腺病毒邸SV-76京911株標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及陰性血清之間均未出現(xiàn)沉淀線。
[00巧]3. 3. 2型特異性鑒定I群禽腺病毒1~12型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清首先作1:10稀釋，再按 2010年版《中國獸藥典》附錄固定病毒稀釋血清法，將I群禽腺病毒1~12型標(biāo)準(zhǔn)毒株、 分離毒對I群禽腺病毒1~12型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進行交叉中和試驗，記錄中和效價結(jié)果。結(jié) 果：分離毒測4型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的中和效價（1:501)與4型標(biāo)準(zhǔn)毒株測4型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清 的中和效價（1:537)較接近；分離毒株測其它型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的中和效價均在1:10W下。 表明分離株是血清4型。
[0026] 3. 4PCR檢測及基因測序病雞肝臟無菌研磨，反復(fù)凍融3次，利用柱式動物DNA提取 試劑盒提取病毒DNA，進行PCR檢測。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。將陽性樣品進行Hexon 基因測序，并進行遺傳進化分析。
[0027] PCR