一種光頭稗的gtb-hm基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種禾本科植物一-光頭碑編碼高蛋氨酸蛋白的GTB-HM基因，屬于分 子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白短缺尤其是優(yōu)質(zhì)蛋白的短缺，是21世紀(jì)全球性的嚴(yán)重問(wèn)題，在盡快提高作物 品種的蛋白質(zhì)含量的同時(shí)，積極改善蛋白質(zhì)的氨基酸組成，提高限制性氨基酸的含量W增 強(qiáng)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，具有重要意義。植物種子儲(chǔ)藏了豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類(lèi)，其中膽 藏于蛋白質(zhì)體內(nèi)的膽藏蛋白是植物種子的主要成分，其功能不僅局限于為種子的正常萌發(fā) 和幼苗生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)供給，而且也參與了種子萌發(fā)和發(fā)育過(guò)程的調(diào)控（趙文明，1995)。
[0003] 硫是僅次于氮、憐、鐘的植物必需的第4大營(yíng)養(yǎng)元素，缺硫時(shí)蛋白質(zhì)合成受阻，導(dǎo) 致非蛋白氮累積，不僅影響作物生長(zhǎng)，而且降低農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)；植物含硫量為0. 1%~0. 5%， 其變幅明顯受植物種類(lèi)、品種、器官和生育期的影響。十字花科植物需硫最多，豆科、百合 科植物次之，禾本科植物較少（陸景陵，1994)。含硫氨基酸如甲硫氨酸（也稱為蛋氨酸， methionine,Met)、脫氨酸、半脫氨酸（cysteine,切S)等是合成蛋白質(zhì)的重要氨基酸；蛋白 質(zhì)中含硫氨基酸的含量與種子萌發(fā)、生長(zhǎng)和作物品質(zhì)均有密切關(guān)系。其中，Met作為人體和 單瘤胃動(dòng)物的必需氨基酸之一，在水稻、小麥、大麥、養(yǎng)麥，尤其是豆類(lèi)和花生等主要的糧食 作物和經(jīng)濟(jì)作物中含量極低，是主要的限制性氨基酸，因此提高運(yùn)些作物的Met含量顯得 尤為重要（趙文明，1995;MilntzK，1998)。
[0004] 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)擴(kuò)大篩選獲得更多高含硫氨基酸的目的基因，利 用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法掲示高M(jìn)et種子膽藏蛋白新的功能（王文軍等，2005)，結(jié)合植物基因 工程的手段改良作物品質(zhì)、調(diào)節(jié)種子生長(zhǎng)發(fā)育等將更具實(shí)際意義化aftBΚ，2005)。
[0005]目前國(guó)際上已經(jīng)分離出來(lái)可供用來(lái)提高作物Met含量的高M(jìn)et植物種子膽藏蛋白 基因?yàn)閿?shù)不多，其主要來(lái)源是玉米（AltenbachSB，1990)和水稻（Masum-uraΤ，1989)，此 外還有少部分來(lái)自己西栗6日日化日油1，1994)、花生度日3}1日8 1，1994)等，我國(guó)尤其落后， 因而充分利用我國(guó)豐富的種質(zhì)資源，合理與有效的發(fā)掘和利用植物資源，分離提取有價(jià)值 的高M(jìn)et植物種子膽藏蛋白基因是W提高作物Met含量為目的品質(zhì)改良基因工程領(lǐng)域迫切 需要的基礎(chǔ)性工作，也將為高M(jìn)et植物種子膽藏蛋白的研究開(kāi)辟新的領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種編碼高蛋氨酸蛋白的光頭碑基因GTB-HM及其編碼高蛋氨酸蛋白 的應(yīng)用；該基因能提高相關(guān)蛋白的表達(dá)，尤其是能夠提高植物中蛋氨酸的含量。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)出引物，W光頭碑DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到該基因全長(zhǎng)序列，經(jīng) T載體克隆并測(cè)序，再轉(zhuǎn)入大豆進(jìn)行強(qiáng)表達(dá)，表明運(yùn)是一條編碼高蛋氨酸蛋白的基因。該基 因編碼區(qū)為40化P，編碼135個(gè)氨基酸，其中含有13個(gè)蛋氨酸，并且在該蛋白中蛋氨酸的摩 爾百分含量達(dá)到9. 62%。
[0008] 因此，本發(fā)明第一個(gè)目的是提供一種編碼高蛋氨酸蛋白的光頭碑基因GTB-HM，其 屬于新的編碼高蛋氨酸蛋白基因，具有或選自SEQIDNO: 1的序列?；蚺cSEQIDNo: 1限 定的核巧酸序列具有90%W上同源性的核巧酸序列；在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQIDNo: 1限 定的DM序列雜交的核巧酸序列。
[0009] 本發(fā)明第二個(gè)目的是提供所述基因所編碼的功能蛋白，其具有或選自SEQID N0:2的蛋白序列，或具有或選自SEQIDNO: 1的基因序列所編碼的蛋白序列?；蚺cSEQID No:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十二個(gè)氨基酸殘基的取代或缺失或添加且對(duì)植物的生長(zhǎng) 發(fā)育具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。
[0010] 本發(fā)明第Ξ個(gè)目的是提供所述基因或功能蛋白，在調(diào)控光頭碑高蛋氨酸蛋白表達(dá) 中的用途；利用該基因，開(kāi)發(fā)更高效、無(wú)毒的光頭碑來(lái)源的具有高蛋氨酸蛋白的功能型食用 蛋白乃至保健品。
[0011] 在具體實(shí)施方案中GTB-HM基因及其調(diào)控元件的表達(dá)載體。
[0012] 在具體實(shí)施方案中GTB-HM基因及其調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0013] 在具體實(shí)施方案中GTB-HM基因及其調(diào)控元件的工程菌。
[0014] 在具體實(shí)施方案中GTB-HM基因及其調(diào)控元件中任一片段的引物對(duì)。
[0015] 在具體實(shí)施方案中GTB-HM基因及其調(diào)控元件中在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的應(yīng)用。
[0016] 在具體實(shí)施方案中GTB-HM基因及其蛋白可應(yīng)用于植物包括單子葉植物和雙子葉 植物。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為PCR基因擴(kuò)增結(jié)果（1為光頭碑PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，Μ為DNAMarker)。圖2為 酶切結(jié)果（1為提取的重組質(zhì)粒，2為重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，Μ為DNA
[001引Marker)。
[0019]圖3 pCAMBIA1390重組質(zhì)粒中連接示意圖（X. Japoni州SUbiquitin promoter PCAMBIA1390)，其中GTB-HM為光頭碑高蛋氨酸基因。
[0020] 技術(shù)效果
[0021] 1、利用本發(fā)明的GTB-HM基因表達(dá)得到含有13個(gè)蛋氨酸的蛋白質(zhì)，有助于蛋氨酸 在大豆中的含量。
[0022] 2、利用本發(fā)明的GTB-HM基因基因和蛋白，可用于已有局蛋氨酸蛋白的研究和應(yīng) 用中，W及開(kāi)發(fā)高效、無(wú)毒的高蛋氨酸蛋白的功能型的蛋白質(zhì)乃至保健品。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，所用的實(shí)驗(yàn)材料均為光頭碑巧chinochloa crusgalli L. Be曰uv. )ο
[0024] 實(shí)施例1、光頭碑總RNA提取
[002引利用RNA提取分離試劑盒化vitrogen公司提供）提取光頭碑巷片中總RNA，其 具體方法是：收集光頭碑巷片lOOmg，立即置于液氮中研磨，加入1mlTrizol試劑，充分混 勻；室溫放置5min;加入0. 2ml新鮮氯仿，劇烈振搖15s，室溫溫育3min;4°C，12000g離屯、 15min;上清水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1. 5ml離屯、管中，加入0. 5ml異丙醇沉淀RNA;RNA沉淀用 1ml75%乙醇洗涂后溶于適量DEPC處理過(guò)的水中，-70°C保存?zhèn)溆谩?br>[0026]實(shí)施例2、光頭碑總RNA純化
[0027] 依據(jù)測(cè)aseI試劑盒（ThermoScientific公司提供）依次向?qū)嵤├?獲得的光 頭碑總RNA中加入6μ1DEPC處理水、10μ1 ΚΝΑ、2μ1面aseIBuffer、2yl面aseI，混 合均勻后，37°C30min，加入邸ΤΑ 2μ1，65ΓlOmin。
[002引實(shí)施例3、光頭碑RNA逆轉(zhuǎn)錄
[0029]第一鏈合成：依據(jù)PlantRT-PCRKit2.01aaKaRa，Japan)的用戶手冊(cè)進(jìn)行。 l-2ng總RNA(大約1-2μ1)，和Kit的各種反轉(zhuǎn)錄試劑混合（MgCMμ1 ; 10XRNAPCR Buffer2μ1;RNaseInhibitor0.5μ1;RNasefreeWater8.5μ1;dNTPMi;rture2μ1; ReverseTranscriptase1μ1 ;01igodT-Adaptor1μ1)。勻后，42°C30min;99°C5min; 5° °C5min，完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0030] 第二鏈合成：根據(jù)生物信息學(xué)提供的序列資料設(shè)計(jì)W下引物：
[0031] 5,端引物（SEQIDNO:3)：5'-CGGGATCCCGATGGCAGCCAAGATGCTTGC-3'；
[0032] 3,端引物（SEQIDNO:4):5'-CGAGCTCGCTAGAATGCAGCACCAACAAAGGG-3'。
[0033] 吸取1 μ 1反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，作為模板與DMTaq酶混合（反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μ 1，上游引 物（沈QIDΝ0:：3)0. 5μ1，下游引物（沈QIDΝ0:4)0. 5μ1，Taq0. 5μ1，10ΧBuffer2yl， Mg2+0. 5 μ l，d地2〇15 μ 1)進(jìn)行PCR反應(yīng)：94°C 5min后進(jìn)入擴(kuò)增程序：94°C lmin、57°C Imin、 72°C Imin, 30個(gè)循環(huán)后，72°C 5min。
[0034] 實(shí)施例4、TA克隆
[003引將實(shí)施例3中所獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖電泳（圖2)分離目的DM片段， 采用膠回收DNA試劑盒（購(gòu)自上海生工生物工程有限公司）方法進(jìn)行回收DNA片段，將回 收的第二鏈合成產(chǎn)物與DNA克隆試劑混合（第二鏈產(chǎn)物6μ1，陽(yáng)G40001μ1，T載體1μ1， 10Χligationbuffer1μl，ligase1μ1)，于 16°C連接過(guò)夜。
[0036] 實(shí)施例5、轉(zhuǎn)化大腸桿菌和目的DNA片段測(cè)序
[0037] 取連接產(chǎn)物5 μ 1與200 μ 1大腸桿菌D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)自上海生工生物工程 有限公司）混勻，冰上放置30min，42°C 90s，冰浴1-2分鐘，加入800 μ 1 LB培養(yǎng)基，于37°C， 250巧m震蕩培養(yǎng)45min，4000巧m離屯、5min，上清留下約150μ1，加入7μ1 IPTG，40yl x-gal混合均勻，涂布于預(yù)先加入Amp(氨節(jié)青霉素）的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，挑取白 色菌落于加有Amp的LB液體培養(yǎng)基中震蕩過(guò)夜，取1ml菌液送至上海生工生物工程有限公 司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明：擴(kuò)增得到的序列SEQ ID NO: 1自起始密碼子到終止密碼子總長(zhǎng)390 堿基，編碼129個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量為14. 2kD，等電點(diǎn)8.74,編碼蛋氨酸17個(gè)，蛋氨酸的 百分摩爾含量為13. 18%。
[003引實(shí)施例6、將目的DNA片段導(dǎo)入大豆中進(jìn)行強(qiáng)表達(dá)
[0039] 從上述含有GTB-HM基因的菌液中提取質(zhì)粒，用甜aI和BamHI進(jìn)行雙酶切，酶切 產(chǎn)物經(jīng)回收后，與同樣經(jīng)甜aI和BamHI雙酶切回收的PCAMBIA1390質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建 重組質(zhì)粒（如圖3);將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌AGL1，通過(guò)Kan和Rif篩選出轉(zhuǎn)化成功的 AGL1菌株，并將其侵染大豆（購(gòu)自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆種質(zhì)資源中屯、）子葉節(jié)，利用潮霉 素篩選獲得GTB-HM基因轉(zhuǎn)染成功的大豆幼苗，并經(jīng)培養(yǎng)獲得大豆種子，通過(guò)氨基酸分析儀 檢測(cè)大豆種子Met含量，發(fā)現(xiàn)其Met含量由對(duì)照的0. 651%提高至3. 968%，表明GTB-HM基 因在大豆中得到了強(qiáng)表達(dá)。
[0040] 沈Q ID NO: 1基因序列表如下：
[0041]
[0042] 沈Q ID NO:2氨基酸序列表如下：
[0043]
[0044]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種光頭稗的GTB-HM基因及其應(yīng)用，其特征在于為下述核苷酸序列之一的基因： (1)SEQIDNo:l； (2) 與SEQIDNo: 1限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列； (3) 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQIDNo: 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。2. 權(quán)利要求1所述GTB-HM基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，其特征在于為下述氨基酸殘基序列之 (1)SEQIDNo:2 ； (2)SEQIDNo:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十二個(gè)氨基酸殘基的取代或缺失或添加 且對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。3. 含有權(quán)利要求1所述的GTB-HM基因及其調(diào)控元件的表達(dá)載體。4. 含有權(quán)利要求1所述的GTB-HM基因及其調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。5. 含有權(quán)利要求1所述的GTB-HM基因及其調(diào)控元件的工程菌。6. 擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的GTB-HM基因及其調(diào)控元件中任一片段的引物對(duì)。7. 權(quán)利要求1所述的GTB-HM基因及其調(diào)控元件中在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，所述的植物包括單子葉植物和雙子葉植物。9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，在調(diào)控光頭稗高蛋氨酸蛋白表達(dá)中的用途；利用 該基因，開(kāi)發(fā)更高效、無(wú)毒的光頭稗來(lái)源的具有高蛋氨酸蛋白的功能型食用蛋白乃至保健 品。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種編碼光頭稗高蛋氨酸蛋白的基因GTB-HM及其編碼蛋白與應(yīng)用。該基因能大大促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，降低非蛋白氮含量，不僅促進(jìn)作物生長(zhǎng)，而且提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類(lèi)】C12N15/11, C12N15/82, A01H5/00, C12N1/21, C12N15/63, C12N15/29, C07K14/415, C12N15/70
【公開(kāi)號(hào)】CN105368845
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510922400
【發(fā)明人】陳宏偉
【申請(qǐng)人】向華
【公開(kāi)日】2016年3月2日
【申請(qǐng)日】2015年12月11日