根據(jù)本發(fā)明所述的方法，優(yōu)選地，步驟2)中，收集步驟1)培養(yǎng)而得的圓紅冬孢酵母菌體的方法為:7000?9000rpm離心，收集菌體，用濃度為15?25mM，pH = 6.5?7的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體，再次離心收集菌體。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式，步驟2)中，收集步驟1)培養(yǎng)而得的圓紅冬孢酵母菌體的方法為:8000rpm離心，收集菌體，用20mM，pH = 6.8的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體，再次離心收集菌體。
[0024]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述圓紅冬孢酵母的菌株為本領域通常采用的那些，優(yōu)選地，所述圓紅冬孢酵母的菌株為如下a)或b)的菌株:
[0025]a)圓紅冬抱酵母(Rhodosporidium toruloides)ACCC 20341 ；
[0026]b)培育自a)的菌株。
[0027]其中，a)的菌株在本領域主要科研機構(例如福建師范大學)都有保存，可以進行索取。也可以直接從保藏機構購買，例如，a)的圓紅冬孢酵母ACCC 20341可以從中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)購得。培育自a)的菌株可以由a)的菌株經(jīng)過各種本領域已經(jīng)披露的培育方法得到。例如，a)的圓紅冬孢酵母ACCC 20341可以經(jīng)過常溫常壓等離子(Atmospheric and room temperature plasma)誘變，得到可以在未脫毒的纖維素水解液中生長代謝的菌株圓紅冬孢酵母(R.toruloides)M18(參考文獻:Feng Qi, YukiKitahara, Zitian Wang, Xuebing Zhao, Wei Du, Dehua L1.Novel mutant strains ofRhodosporidiumtoruloides by plasma mutagenesis approach and their tolerance forinhibitors in lignocellulosichydrolyzate.Journal of Chemical Technology and Biotechnology.2014, 89(5):735 - 742)。
[0028]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，優(yōu)選地，步驟2)得到的發(fā)酵液用有機溶劑提取總油脂，所述有機溶劑可以為本領域采用的各種提取微生物總油脂的有機溶劑。優(yōu)選地，所述有機溶劑為體積比為2?5:1的正己烷和乙醇，更優(yōu)選為體積比為2.5?3.5:1的正己烷和乙醇。
[0029]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，優(yōu)選地，提取總油脂的方法為:7000?9000rpm離心所得發(fā)酵液，用pH = 6.5?7的磷酸鹽緩沖液洗滌離心的菌體，最后用濃度為5?7mol/L的鹽酸重懸，70?90°C水浴酸解30?lOOmin ;加入所述有機溶劑萃取其中的油脂，重復萃取3?5次，合并上清液，蒸發(fā)所述有機溶劑后即得含α_亞麻酸的總油脂。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式，提取總油脂的方法為:8000rpm離心所得發(fā)酵液，用pH = 6.8的磷酸鹽緩沖液洗滌離心的菌體，最后用6mol/L的鹽酸重懸，80°C水浴酸解40min ;加入所述有機溶劑萃取其中的油脂，重復萃取3次，合并上清液，蒸發(fā)所述有機溶劑后即得含α -亞麻酸的總油脂。
[0030]圓紅冬孢酵母胞內(nèi)油脂積累量能夠達到細胞干重的60%以上，但是生產(chǎn)出來的油脂一般用作生物柴油等能源用途。本發(fā)明通過兩段式的發(fā)酵培養(yǎng)方法強化了圓紅冬孢酵母胞內(nèi)油脂中α-亞麻酸的產(chǎn)量，可用于保健品，提升了圓紅冬孢酵母油脂的利用價值。此夕卜，采用本發(fā)明優(yōu)選的方案，亦即以葡萄糖和木糖作為混合碳源、以谷氨酸鈉或蛋白胨為優(yōu)化氮源來發(fā)酵圓紅冬孢酵母，并保持發(fā)酵過程的碳氮比，這樣可以顯著增加圓紅冬孢酵母胞內(nèi)合成α-亞麻酸的量。
[0031]總體而言，本發(fā)明的方法操作簡單，α-亞麻酸產(chǎn)率提升顯著，過程控制容易，非常適于α-亞麻酸的產(chǎn)業(yè)化量產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0032]下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于此。
[0033]除非特別聲明，本發(fā)明的“ ％”表示重量百分比wt%。本發(fā)明的“mM”表示mmol/L。
[0034]本發(fā)明實施例中未限定配方的YEH)培養(yǎng)基均按照如下配方配置:10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，pH5.8?6.0。
[0035]本發(fā)明的實施例所得的總油脂中的α-亞麻酸的含量采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行檢測，檢測條件如下:安捷倫6890N-5975C，HP-1NN0WAX極性毛細管柱，0.25 ymX250 ymX30m ;載氣:氦氣；載氣流量:L OmL/min,恒定流量；上樣分流比為20:1 ;進樣量1 μ L ;進樣口和檢測器溫度為280°C;升溫程序:180°C保持lmin，10°C /min升溫至220°C，2°C /min升溫至240°C，保持5min。260°C后運行3min，全掃描。
[0036]實施例1
[0037]米用圓紅冬抱酵母(Rhodosporidiumtoruloides)ACCC 20341作為發(fā)酵菌株。
[0038]圓紅冬孢酵母R.toruloides菌株從斜面保藏培養(yǎng)基活化，斜面保藏培養(yǎng)基組成為YEH):葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，瓊脂粉15g/L，pH 5.8?6.0，在115。。下飽和蒸汽滅菌20min。上述保藏的圓紅冬孢酵母R.toruloides菌株使用YEH)培養(yǎng)基進行活化，在500mL三角瓶中培養(yǎng)，裝液量200mL，30°C，200rpm培養(yǎng)48h至0D6QQ= 12。
[0039]然后酵母細胞進行離心，收集菌體，接種至10L發(fā)酵罐中進行補料發(fā)酵培養(yǎng)，裝液量6L。補料發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖20g/L，木糖30g/L，谷氨酸鈉6.2g/L,無機鹽ΚΗ2Ρ04:0.52%, K2HP04:0.16%,MgCl2:0.48%。發(fā)酵過程中，通過流加含有20g/L的葡萄糖和30g/L的木糖的混合碳源水溶液，保持限氮培養(yǎng)基的總碳氮比為100:1，pH 5.8?6.0 ;連續(xù)補料發(fā)酵120h后，發(fā)酵停止。取10mL發(fā)酵液8000r/min離心，用5mL pH = 6.8的磷酸鹽(Κ2ΗΡ04-ΚΗ2Ρ04)緩沖液洗滌離心的菌體3遍，然后用5mL濃度為6mol/L的鹽酸重懸，80°C水浴酸解40min。然后加入正己烷和乙醇體積比3:1的混合液來萃取其中的油脂，此步重復3次，合并上清液，使用旋轉蒸發(fā)儀將有機溶劑蒸干即得微生物總油脂。經(jīng)過氣相色譜-質(zhì)譜儀檢測，總油脂中的十八碳三烯酸為α -亞麻酸(cisA9，12，15)，α -亞麻酸的產(chǎn)量達到了細胞總油脂的5.01%。
[0040]實施例2
[0041]采用菌株為圓紅冬孢酵母ACCC 20341經(jīng)過常溫常壓等離子(Atmosphericand room temperature plasma)誘變得到的可以在未脫毒的纖維素水解液中生長代謝的菌株圓紅冬孢酵母R.toruloides M18(參考文獻:Feng Qi, YukiKitahara,Zitian Wang, Xuebing Zhao, Wei Du，Dehua L1.Novel mutant strains ofRhodosporidiumtoruloides by plasma mutagenesis approach and their tolerance forinhibitors in lignocellulosichydrolyzate.Journal of Chemical Technology and Biotechnology.2014，89 (5): 735 - 742) 0
[0042]使用YEH)培養(yǎng)基對上述誘變R.toruloides M18進行活化，在500mL三角瓶中培養(yǎng)，裝液量2001^，30°(:，200印111培養(yǎng)4811至006。。= 12。然后酵母細胞進行離心，收集菌體，接種至10L發(fā)酵罐中進行補料發(fā)酵培養(yǎng)，裝液量6L。
[0043]使用纖維素水解液作為補料培養(yǎng)基的主要成分:取榨糖后的500g甘蔗渣粉置于1000ml圓底燒瓶中，按液固比10:l(w/w)加入0.5%的稀硫酸溶液