一種制備具有抗氧化活性鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物活性多糖提取的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備具有抗氧化活性鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]—直以來(lái)，蘑菇被認(rèn)為是食用和醫(yī)藥原料的重要來(lái)源之一，但自然界中仍然有大量的具有醫(yī)藥產(chǎn)品前景的蘑菇資源未被開(kāi)發(fā)利用。據(jù)報(bào)道，蘑菇中含有大量具有生物活性的大分子，特別是具有抗癌和免疫刺激活性的多糖類物質(zhì)受到越來(lái)越多的關(guān)注。研究表明，擔(dān)子菌類蘑菇中的子實(shí)體、菌絲體和發(fā)酵液中均有生物活性多糖存在。因此，如何開(kāi)發(fā)新的蘑菇資源并利用現(xiàn)代化技術(shù)制備各種生物活性多糖越來(lái)越受到科研人員的關(guān)注。
[0003]鱗傘屬是蘑菇球蓋茹科中的一個(gè)小家族，約包含150余種，含有豐富的維生素，氨基酸，微量元素，脂類和多糖，同時(shí)鱗傘菌中有多種抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂等作用的生物活性物質(zhì)。鼎湖鱗傘菌(Phol1ta dinghuensis Bi)于1985年在中國(guó)廣東省被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)鑒定屬于鱗傘屬中的新種，而且是中國(guó)特有的新種，但目前對(duì)鼎湖鱗傘菌中活性物質(zhì)的研究報(bào)道較少。
[0004]與培育真菌子實(shí)體相比，液體深層發(fā)酵法制備菌絲體具有占地少、生產(chǎn)周期短、單位產(chǎn)率高的優(yōu)點(diǎn)，且生產(chǎn)過(guò)程容易控制，目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在提供一種高效制備具有抗氧化活性鼎湖鱗傘胞內(nèi)、胞外多糖的方法，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體方案如下:
[0006](1)將鼎湖鱗傘菌種在馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上于隔水式恒溫培養(yǎng)箱中28°C培養(yǎng)8-10天，直至菌絲長(zhǎng)滿斜面。
[0007](2)從馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上挑取0.5cm2大小的母種塊，接種于種子培養(yǎng)基中，于28°C靜止培養(yǎng)12小時(shí)后，150rpm下振蕩培養(yǎng)10-15天。種子培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖20，蛋白質(zhì)胨3，酵母膏4，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂1 ;裝液量為100mL/250mL。
[0008](3)取步驟(2)中的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為15% (V/V)，于28°C、120rpm的條件下培養(yǎng)10-15天，發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖45 ;酵母膏6，磷酸二氫鉀1.5，硫酸鎂0.5，馬鈴薯100，麥芽粉2.5 ;裝液量為200mL/500mL。
[0009](4)將發(fā)酵產(chǎn)物用濾紙進(jìn)行減壓過(guò)濾，得到鼎湖鱗傘的菌絲體和發(fā)酵液；將菌絲體用去離子水沖洗三次，55°C烘干至恒重，粉碎，過(guò)60目篩，用去離子水以料液比1: 10，于90°C熱水浴中提取3小時(shí)，濾渣重復(fù)提取一次，合并提取液；將菌絲體提取液和發(fā)酵液分別經(jīng)4000rpm離心15min，取上清，真空濃縮至原體積的1/5，加入3倍體積的酒精，充分混勾，4°C下靜置過(guò)夜，4000rpm離心20min，收集粗多糖沉淀，依次用丙酮和無(wú)水乙醚各洗滌兩次，復(fù)溶后真空冷凍干燥，得鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外粗多糖。
[0010]液體發(fā)酵法制備鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外粗多糖產(chǎn)量分別為429mg/L和930mg/L。
[0011](5)粗多糖溶解液上樣于DEAE Sepharose Fast Flow (2.0 X 60cm)，并分別用去離子水、0.lmol/L NaCl和0.3mol/L NaCl進(jìn)行洗脫收集，流速為2mL/min。采用硫酸-苯酸法檢測(cè)洗脫液中的多糖含量，合并相同組分，50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，去離子水透析2d，真空冷凍干燥，分別得胞內(nèi)、胞外多糖組分。
[0012](6)將步驟(5)所得胞內(nèi)、胞外多糖組分經(jīng)S印hadex G-100凝膠柱純化后得胞內(nèi)、胞外純化多糖組分，并配制成一系列濃度溶液，測(cè)定其對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力。
[0013]制備的鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基均有一定的清除能力。
[0014]2、根據(jù)專利要求1所述的一種制備具有抗氧化活性鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖的方法，其特征在于:采用液體深層發(fā)酵法培養(yǎng)鼎湖鱗傘菌，同時(shí)提取胞內(nèi)、胞外多糖，產(chǎn)量分別為 429mg/L 和 930mg/L。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1鼎湖鱗傘菌絲體多糖的DEAE凝膠柱梯度洗脫曲線
[0016]圖2鼎湖鱗傘菌胞外多糖的DEAE凝膠柱梯度洗脫曲線
[0017]圖3鼎湖鱗傘菌胞外多糖對(duì)DPPH自由基的清除活性
[0018]圖4鼎湖鱗傘菌胞外多糖對(duì)羥基自由基的清除活性
[0019]圖5鼎湖鱗傘菌胞外多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除活性
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面通過(guò)實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0021]實(shí)施例1:
[0022](1)將鼎湖鱗傘菌種在馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上于隔水式恒溫培養(yǎng)箱中28°C培養(yǎng)8-10天，直至菌絲長(zhǎng)滿斜面。
[0023](2)從馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上挑取0.5cm2大小的母種塊，接種于種子培養(yǎng)基中，于28°C靜止培養(yǎng)12小時(shí)后，150rpm下振蕩培養(yǎng)10-15天。種子培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖20，蛋白質(zhì)胨3，酵母膏4，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂1 ;裝液量為100mL/250mL。
[0024](3)取步驟(2)中的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為15% (V/V)，于28°C、120rpm的條件下培養(yǎng)10-15天，發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖45 ;酵母膏6，磷酸二氫鉀1.5，硫酸鎂0.5，馬鈴薯100，麥芽粉2.5 ;裝液量為200mL/500mL。
[0025](4)將發(fā)酵產(chǎn)物用濾紙進(jìn)行減壓過(guò)濾，得到鼎湖鱗傘的菌絲體和發(fā)酵液；將菌絲體用去離子水沖洗三次，55°C烘干至恒重，粉碎，過(guò)60目篩，用去離子水以料液比1: 10，于90°C熱水浴中提取3小時(shí)，濾渣重復(fù)提取一次，合并提取液；將菌絲體提取液和發(fā)酵液分別經(jīng)4000rpm離心15min，取上清，真空濃縮至原體積的1/5，加入3倍體積的酒精，充分混勾，4°C下靜置過(guò)夜，4000rpm離心20min，收集粗多糖沉淀，依次用丙酮和無(wú)水乙醚各洗滌兩次，復(fù)溶后真空冷凍干燥，得鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外粗多糖。
[0026]液體發(fā)酵法制備鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外粗多糖產(chǎn)量分別為429mg/L和930mg/L。
[0027]實(shí)施例2:
[0028]鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖的分離純化及體外抗氧化活性分析
[0029](1)粗多糖溶解液上樣于DEAE Sepharose Fast Flow (2.0 X 60cm)，并分別用去離子水、0.lmol/L NaCl和0.3mol/L NaCl進(jìn)行洗脫收集，流速為2mL/min。采用硫酸-苯酸法檢測(cè)洗脫液中的多糖含量，合并相同組分，50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，去離子水透析2d，真空冷凍干燥，分別得胞內(nèi)、胞外多糖組分。
[0030](2)將步驟(5)所得胞內(nèi)、胞外多糖組分經(jīng)S印hadex G-100凝膠柱純化后得胞內(nèi)、胞外純化多糖組分，并配制成一系列濃度溶液，測(cè)定其對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力。
[0031]制備的鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基均有一定的清除能力。
[0032]鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖產(chǎn)量按下面公式計(jì)算:
[0033]多糖產(chǎn)量(mg/L)=[粗多糖質(zhì)量(mg)/發(fā)酵液體積(L)]
[0034]DPPH 清除率(％ ) = [A0- (ArA2) ]/A0X100%
[0035]其中A。為對(duì)照實(shí)驗(yàn)(水代替樣品溶液)的吸光值；
[0036]Ai為樣品實(shí)驗(yàn)的吸光值；
[0037]^為樣品干擾實(shí)驗(yàn)(無(wú)水乙醇代替DPPH溶液)的吸光值。
[0038]羥基清除率(%) = [ (A2_Ai) / (Ao-Ai) ] X 100%
[0039]其中:
[0040]A。-正常管(50 μ L 鄰二氮菲 +75 μ L PBS+50 μ L FeS04+100 μ L H20)的吸光值；[0041 ] A「陰性對(duì)照管(50 μ L鄰二氮菲 +75 μ L PBS+50 μ L FeS04+50 μ L H20+50 μ L H202)的吸光值；
[0042]A2-樣品管(50 μ L鄰二氮菲 +75 μ L PBS+50 μ L FeS04+50 μ L 多糖 +50 μ L H202)的吸光值。
[0043]超氧陰離子自由基清除率) = [A0-(A1-A2)]/A0X100%
[0044]其中:
[0045]A。-對(duì)照實(shí)驗(yàn)(水代替樣品溶液)的吸光值；
[0046]A1-樣品實(shí)驗(yàn)的吸光值；
[0047]A2-樣品干擾實(shí)驗(yàn)(0.1M pH 7.4酸鹽緩沖液代替NBT溶液)的吸光值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種液體發(fā)酵制備鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖的方法，其特征在于包括以下操作步驟: (1)將鼎湖鱗傘菌種在馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上于隔水式恒溫培養(yǎng)箱中28°C培養(yǎng)8-10天，直至菌絲長(zhǎng)滿斜面。 (2)從馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上挑取0.5cm2大小的母種塊，接種于種子培養(yǎng)基中，于28°C靜止培養(yǎng)12小時(shí)后，150rpm下振蕩培養(yǎng)10-15天。種子培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖20，蛋白質(zhì)胨3，酵母膏4，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂1 ;裝液量為100mL/250mL。 (3)取步驟(2)中的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為15%(V/V)，于28°C、120rpm的條件下培養(yǎng)10-15天，發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖45 ;酵母膏6，磷酸二氫鉀1.5，硫酸鎂0.5，馬鈴薯100，麥芽粉2.5 ;裝液量為200mL/500mL。 (4)將發(fā)酵產(chǎn)物用濾紙進(jìn)行減壓過(guò)濾，得到鼎湖鱗傘菌的菌絲體和發(fā)酵液；將菌絲體用去離子水沖洗三次，55°C烘干至恒重，粉碎，過(guò)60目篩，用去離子水以料液比1: 10，于90°C熱水浴中提取3小時(shí)，濾渣重復(fù)提取一次，合并提取液；將菌絲體提取液和發(fā)酵液分別經(jīng)4000rpm離心15min，取上清，真空濃縮至原體積的1/5，加入3倍體積的酒精，充分混勾，4°C下靜置過(guò)夜，4000rpm離心20min，收集粗多糖沉淀，依次用丙酮和無(wú)水乙醚各洗滌兩次，復(fù)溶后真空冷凍干燥，得鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外粗多糖。 液體發(fā)酵法制備鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外粗多糖產(chǎn)量分別為429mg/L和930mg/L。 (5)粗多糖溶解液上樣于DEAESepharose Fast Flow(2.0X60cm)，并分別用去離子水、0.lmol/L NaCl和0.3mol/L NaCl進(jìn)行洗脫收集，流速為2mL/min。采用硫酸-苯酸法檢測(cè)洗脫液中的多糖含量，合并相同組分，50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，去離子水透析2d，真空冷凍干燥，分別得胞內(nèi)、胞外多糖組分。 (6)將步驟(5)所得胞內(nèi)、胞外多糖組分經(jīng)SephadexG-100凝膠柱純化后得胞內(nèi)、胞外純化多糖組分，并配制成一系列濃度溶液，測(cè)定其對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力。 制備的鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基均有一定的清除能力。2.根據(jù)專利要求1所述的一種制備具有抗氧化活性鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖的方法，其特征在于:采用液體深層發(fā)酵法培養(yǎng)鼎湖鱗傘菌，同時(shí)提取胞內(nèi)、胞外多糖，產(chǎn)量分別為 429mg/L 和 930mg/L。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種制備具有抗氧化活性鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖的方法。該方法包括采用液體深層發(fā)酵法培養(yǎng)鼎湖鱗傘菌，菌絲體用去離子水沖洗三次，經(jīng)干燥、粉碎、熱水浸提、乙醇沉淀、復(fù)溶、冷凍干燥得菌絲體多糖；發(fā)酵液經(jīng)濾膜分離、減壓濃縮、乙醇沉淀、復(fù)溶、冷凍干燥得胞外多糖。體外清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的實(shí)驗(yàn)表明鼎湖鱗傘菌胞外多糖具有一定的體外抗氧化活性。本發(fā)明綜合利用鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖，具有利用率高、工藝溫和、成本低等優(yōu)點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)利用藥用真菌資源開(kāi)辟了新的途徑。
【IPC分類】C12R1/645, C12P19/04
【公開(kāi)號(hào)】CN105368895
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510656990
【發(fā)明人】曾曉雄, 邱麗淳, 吳凡
【申請(qǐng)人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年3月2日
【申請(qǐng)日】2015年10月10日