焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)mthfr基因分型的引物對(duì)及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及體外核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種焦憐酸測(cè)序法檢測(cè)MTHFR基因 分型的引物對(duì)及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 亞甲基四氨葉酸還原酶（Methylenete-tr址y血folatereductase,MTHFR)是葉 酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，MTHFR基因位于1號(hào)染色體短臂上（lp36. 3)，包括11個(gè)外顯子和 10個(gè)內(nèi)含子，cDNA全長(zhǎng)2. 2化。MTHFR在體內(nèi)有重要的生物學(xué)作用，是機(jī)體一碳基團(tuán)代謝關(guān) 鍵酶，也是甲硫氨酸代謝中的關(guān)鍵酶，可催化還原型輔酶I(NADPH)相關(guān)的5,10-二甲基四 氨葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氨葉酸的不可逆還原反應(yīng)。該酶可將還原型葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基四 氨葉酸巧-MTHF)，前者是胸巧酸合成的重要原料之一，是血漿中葉酸存在的主要形式，可為 DNA和RNA核酸堿基合成、S-腺巧甲硫氨酸合成、高半脫氨酸再甲基化為蛋氨酸，W及DNA、 蛋白質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)及憐脂的甲基化提供一碳基團(tuán)，參與DNA的合成與修復(fù)；后者是體內(nèi)主要 的甲基供體，參與DNA甲基化。MTHFR對(duì)于DNA的合成、活化及修復(fù)有著極為重要的調(diào)控作 用，其功能異?？蓪?dǎo)致DNA正常功能不能維持。
[000引至今，已發(fā)現(xiàn)MTHFR近20個(gè)基因突變位點(diǎn)，其中部分多態(tài)位點(diǎn)的錯(cuò)義突變是導(dǎo)致 酶活性降低、缺失及熱穩(wěn)定性改變的主要機(jī)制。目前，研究報(bào)道較多的是與人類疾病關(guān)系密 切的多態(tài)位點(diǎn)C677T和A1298C。
[0004]C677T是MTHFR最常見(jiàn)的突變，產(chǎn)生Ala222Val錯(cuò)義突變，主要引起酶活性和熱穩(wěn) 定性的改變，TT突變純合型酶活性僅為CC野生型的30%，而CT突變雜合型酶活性僅為CC 野生型的60%，同時(shí)酶的熱穩(wěn)定性下降，使酶活性顯著降低，使體內(nèi)5,10-亞甲基四氨葉酸 (5,10-MTH巧水平升高、5-甲基四氨葉酸巧-MTH巧水平隨之下降，進(jìn)而影響葉酸正常代謝， W及甲氨蝶嶺、5-氣尿喀晚巧-FU)等藥物的療效和毒副作用。
[0005]MTHFRA1298C突變位點(diǎn)位于第7外顯子，產(chǎn)生Glu429Ala錯(cuò)義突變，同時(shí)產(chǎn)生限 制性內(nèi)切酶MboII的酶切位點(diǎn)。該多態(tài)性位點(diǎn)位于酶的S-腺巧蛋氨酸（SAM)調(diào)節(jié)域，SAM 與MTHFR的結(jié)合可通過(guò)構(gòu)象的轉(zhuǎn)變抑制酶的活性。體外試驗(yàn)表明，MTHFR1298CC突變純合 型酶的活性僅是AA野生型的60%，而1298AC突變雜合型與677CT突變雜合型聯(lián)合酶的活 性也只是AA野生型的50% -60%。
[0006] 多項(xiàng)研究顯示，具有MTHFR變異型的癌細(xì)胞MTHFR活性降低，細(xì)胞增殖速度加快， 對(duì)5-FU藥物的敏感性增高。MTHFR基因突變型的病患使用5-FU藥物的有效率較高。MTHFR 基因型除了影響5-RJ的治療效果外，也會(huì)影響氨甲噪嘟（MT訝的治療效果。對(duì)胃癌、食道 癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等疾病患者進(jìn)行MTHFR基因型檢測(cè)，對(duì)幫助患者預(yù)測(cè)5-FU化療藥物治 療效果具有重要意義。
[0007] 5-氣尿喀晚（Fluorouracil，5-FU)為喀晚類似物，屬于抗代謝藥的一種，進(jìn)入體 內(nèi)后，在胸巧激酶的催化下轉(zhuǎn)變成5-氣-2-脫氧尿巧-5-單憐酸鹽，再與5,10-MTHF及胸 巧酸合成酶形成共價(jià)絡(luò)合物，從而干擾DNA的合成和修復(fù)。MTHFR能將5,10-MTHF轉(zhuǎn)變成 5-MTHF，從而參與蛋氨酸代謝循環(huán)和DM甲基化。因此，MTHFR的活性將直接影響體內(nèi)5， 10-MTHF的濃度，進(jìn)而影響5-FU療效。研究結(jié)果表明，MTHFR基因第677位堿基的C〉T突變 可W導(dǎo)致酶活性顯著下降，從而增加對(duì)5-RJ的敏感性。因此，MTHFR基因6770T多態(tài)性可 用于指導(dǎo)該類藥物的個(gè)體化使用，W提高臨床治療的針對(duì)性和可預(yù)見(jiàn)性。
[0008]甲氨蝶嶺（Methotrexate，MTX)是葉酸括抗劑，能抑制亞甲基四氨葉酸還原酶 (MTHFR)，在急性淋己細(xì)胞白血病（特別在侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)）、煩內(nèi)原發(fā)性中樞神經(jīng)系 統(tǒng)淋己瘤（Primarycentralnervoussystemlymphoma,PCN化）、惡性葡萄胎、絨毛膜上皮 癌、乳腺癌、盆腔腫瘤、頭頸部腫瘤、肺癌及骨肉瘤等多種腫瘤的化療中發(fā)揮重要作用。但在 治療過(guò)程中患者常出現(xiàn)不良反應(yīng)，包括胃腸道反應(yīng)、骨髓移植和肝功能損害等。研究發(fā)現(xiàn)， MTHFR基因第677位堿基的C〉T突變顯著增加MTX的毒副作用；此外，6770T多態(tài)性與葉酸 及同型半脫氨酸代謝素亂、血栓形成傾向、屯、腦血管病風(fēng)險(xiǎn)增高、孤獨(dú)癥及新生兒缺陷等疾 病具有顯著相關(guān)性。
[0009] 焦憐酸測(cè)序（Pyrosequencing)是一種基于聚合原理的DNA測(cè)序（即，確定DNA 中核巧酸的順序）方法，屬于新一代DNA序列分析技術(shù)，具備同時(shí)對(duì)大量樣品進(jìn)行測(cè)序分 析的能力，并具有高通量、特異性高、快速、直觀及低成本的優(yōu)點(diǎn)。其基本原理為，由4種酶 催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若 該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可W將其滲入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦憐酸基團(tuán) (PPi)，PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見(jiàn)光信號(hào)，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值，每個(gè)峰值的高度 與反應(yīng)中滲入的核巧酸數(shù)目成正比；然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成；最后通過(guò)分 析出峰值的情況，達(dá)到測(cè)定DNA序列的目的。不過(guò)，現(xiàn)有技術(shù)中還沒(méi)有利用焦憐酸測(cè)序技術(shù) 檢測(cè)MTHFR基因分型的產(chǎn)品。
[0010] 目前，在現(xiàn)有技術(shù)中，尤其是在醫(yī)院內(nèi)，采用有"金標(biāo)準(zhǔn)"之稱的PCR-直接測(cè)序法 對(duì)MTHFR基因進(jìn)行檢測(cè)，但該方法的敏感性不高，只能檢測(cè)出突變細(xì)胞比率在10-20%W上 的腫瘤組織及外周血，對(duì)于突變細(xì)胞比率小于10%的腫瘤組織及外周血，常規(guī)PCR-直接測(cè) 序法幾乎無(wú)能為力；此外，該方法還存在成本高、檢測(cè)周期長(zhǎng)及操作繁瑣的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 為了解決上述方法檢測(cè)MTHFR基因分型過(guò)程中存在敏感性不高、檢測(cè)周期長(zhǎng)、操 作繁瑣及成本高的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)周期短、操作簡(jiǎn)單 并有效滿足臨床檢驗(yàn)要求的焦憐酸測(cè)序法檢測(cè)MTHFR基因分型的引物對(duì)及試劑盒。
[0012] 本發(fā)明提供了一種焦憐酸測(cè)序法檢測(cè)MTHFR基因分型的引物對(duì)，所述MTHFR基因 檢測(cè)的多態(tài)性位點(diǎn)為MTHFRC677T和/或MTHFRA1298C，所述引物對(duì)包括：
[0013] (1)對(duì)于MTHFRC677T等位基因，
[0014] 擴(kuò)增引物為：
[001引MTHFRC677T正向擴(kuò)增引物：
[0016] 5' -GCCAGCCTCTCCTGACTGTC-3'(沈QIDNO. 1);
[0017]MTHFRC677T反向擴(kuò)增引物：
[0018] 5, -TCGGTGCATGCCTTCACA-3'（沈QIDNO. 2);
[0019]MTHFRC677T測(cè)序引物：5, -TGCGTGATGATGAAAT-3,（沈QIDNO. 3);
[0020] 其中，所述MTHFRC677T正向擴(kuò)增引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0021] (2)對(duì)于MTHFRA1298C等位基因，
[0022] 擴(kuò)增引物為：
[0023] MTHFRA1298C正向擴(kuò)增引物：
[0024] 5' -AGGAGCTGCTGAAGATGTGG-3'（沈QIDNO. 4);
[00巧]MTHFRA1298C反向擴(kuò)增引物：
[0026] 5, -CTCCCGAGAGGTAAAGAACGAA-3,（沈QIDNO. 5);
[0027] MTHFRA1298C測(cè)序引物：5, -AGGAGCTGACCAGTGA-3'（SEQIDNO. 6);
[0028] 其中，所述MTHFRA1298C反向擴(kuò)增引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種焦憐酸測(cè)序法檢測(cè)MTHFR基因分型的試劑盒，所述MTHFR基 因檢測(cè)的多態(tài)性位點(diǎn)為MTHFRC677T和/或MTHFRA1298C，所述試劑盒包括：
[0030] (1)對(duì)于MTHFRC677T等位基因，
[0031] MTHFRC677T正向擴(kuò)增引物：
[0032] 5, -GCCAGCCTCTCCTGACTGTC-3,；
[0033] PCR反應(yīng)液1，所述PCR反應(yīng)液1含有MTHFRC677T反向擴(kuò)增引物： 5, -TCGGTGCATGCCTTCACA-