用于辣椒品種匯豐2號(hào)種子純度鑒定的ssr引物組及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子標(biāo)記技術(shù)，具體涉及利用SSR分子標(biāo)記檢測(cè)辣椒品種‘匯豐2號(hào)’種子純度的引物組及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]‘匯豐2號(hào)’是一個(gè)雜交一代辣椒品種，中早熟，具有耐貯運(yùn)，品質(zhì)佳等特性，同時(shí)抗疫病并且耐熱、耐寒、耐澇和耐旱能力強(qiáng)，深受消費(fèi)者和戶喜愛(王恒明，李穎，郭漢權(quán)，等.早中熟優(yōu)質(zhì)辣椒新品種‘匯豐2號(hào)’ [J].園藝學(xué)報(bào)，2010，02期:337-338.)。由于辣椒是一種常見的異花授粉作物，以自交為主，同時(shí)存在一定的天然雜交(〈50%)。因此在h制種時(shí)即使是其他方法制種(如雄性不育的利用)，也需要人工輔助授粉。在？1代雜交種制種過程中由于生物學(xué)混雜和人工操作混雜等原因造成雜交種純度降低的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，給種子生產(chǎn)者、經(jīng)營(yíng)者和農(nóng)戶造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，在制種后和銷售前對(duì)辣椒h代雜種子進(jìn)行純度鑒定是必不可少的。
[0003]目前辣椒種子純度鑒定通常采用田間小區(qū)種植，以形態(tài)觀察的辦法，但由于辣椒生育期長(zhǎng)，形態(tài)學(xué)鑒定通常需要60-120天，周期長(zhǎng)，受環(huán)境影響大，準(zhǔn)確性較低且耗費(fèi)人力、財(cái)力，所以其應(yīng)用受到限制。隨著分子生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，使從DNA水平準(zhǔn)確、可靠地對(duì)種子純度進(jìn)行鑒定成為現(xiàn)實(shí)。簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeat，SSR)是一類廣泛分布于基因組上的DNA序列，根據(jù)其在不同材料間產(chǎn)生不同的重復(fù)次數(shù)從而產(chǎn)生多態(tài)SSR標(biāo)記。SSR標(biāo)記是一種共顯性標(biāo)記，具有多態(tài)性好、重復(fù)性高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種發(fā)展前景看好的DNA指紋技術(shù)，目前已廣泛運(yùn)用于水稻、玉米等作物種子純度鑒定，隨著其它小作物基因組學(xué)的迅速發(fā)展，利用SSR分子標(biāo)記檢測(cè)種子純度的方法也在黃瓜、甘藍(lán)等蔬菜作物中得以應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供用于鑒定辣椒品種‘匯豐2號(hào)’種子純度的SSR分子標(biāo)記、SSR引物組及方法。
[0005]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種用于鑒定辣椒品種‘匯豐2號(hào)’種子純度的SSR分子標(biāo)記L0143，其定位于辣椒第1號(hào)染色體上，包括母本L0143-1和父本L0143-2，其大小分別為141bp和149bp。
[0006]優(yōu)選的，所述SSR分子標(biāo)記L0143，其母本L0143-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，父本L0143-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]用于PCR擴(kuò)增上述SSR分子標(biāo)記L0143的引物對(duì)。
[0008]優(yōu)選的，用于PCR擴(kuò)增SSR分子標(biāo)記L0143的引物對(duì)，其序列如下所示:
L0143F:ATGGAGCACCATACTCAAACAACC (SEQ ID N0.3)；
L0143R:GTTTACATCTCCCGACTGAAACTCCG (SEQ ID N0.4)。
[0009]一種用于鑒定辣椒品種‘匯豐2號(hào)’種子純度的SSR分子標(biāo)記L0622，其定位于辣椒第6號(hào)染色體上，包括母本L0622-1和父本L0622-2，其大小分別為196bp和208bp。
[0010]優(yōu)選的，所述SSR分子標(biāo)記L0622，其母本L0622-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，父本L0622-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0011]用于PCR擴(kuò)增上述SSR分子標(biāo)記L0622的引物對(duì)。
[0012]優(yōu)選的，用于PCR擴(kuò)增SSR分子標(biāo)記L0622的引物對(duì)，其序列如下所示:
L0622F:GCTCATCAACCCACCTTCATCA (SEQ ID N0.7)；
L0622R:ATGCGTTGTCCGAGTAGGGAAG (SEQ ID N0.8)。
[0013]一種利用SSR引物組鑒定辣椒品種‘匯豐2號(hào)’種子純度的方法，包括如下步驟:
(1)以待檢測(cè)辣椒幼苗基因組DNA為模板，使用上述L0143和/或L0622的SSR引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
(2)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)；如果產(chǎn)物中同時(shí)含有SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的條帶，或者同時(shí)含有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的條帶，則該辣椒樣品為‘匯豐2號(hào)’真雜種。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明的SSR標(biāo)記、引物組以及方法可將‘匯豐2號(hào)’雜交種與其母本、父本區(qū)分開來，快速檢測(cè)出雜交種子的純度。本方法具有快速、準(zhǔn)確、低成本和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，能夠替代傳統(tǒng)雜交種子純度鑒定的方法，具有較高的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
[0015]本發(fā)明引物組還可以用于辣椒品種‘粵紅1號(hào)’、‘匯豐1號(hào)’、和‘匯豐5號(hào)’種子真?zhèn)涡缘蔫b定。
【附圖說明】
[0016]圖1為L(zhǎng)0143引物對(duì)鑒定辣椒品種‘匯豐2號(hào)’種子純度的部分PCR產(chǎn)物電泳圖，其中PpP2*別為母本和父本泳道，其特征帶型分別長(zhǎng)141bp和149bp ;編號(hào)1-20為‘匯豐2號(hào)’雜交種泳道，除編號(hào)17的單株為父本特征帶型外，其它都同時(shí)具有母本和父本特征條帶；
圖2為L(zhǎng)0622引物對(duì)鑒定辣椒品種‘匯豐2號(hào)’種子純度的部分PCR產(chǎn)物電泳圖，其中P1、P^別為母本和父本泳道，其特征帶型分別長(zhǎng)196bp和208bp ;編號(hào)1-20為‘匯豐2號(hào)’雜交種泳道，除編號(hào)17的單株為父本特征帶型外，其它都同時(shí)具有母本和父本特征條帶；圖3為L(zhǎng)0143和L0622的引物對(duì)同時(shí)擴(kuò)增‘粵紅1號(hào)’、‘匯豐1號(hào)’、‘匯豐2號(hào)’和‘匯豐5號(hào)’4個(gè)辣椒品種的電泳圖，其中第1、2泳道分別為L(zhǎng)0143和L0622的引物對(duì)擴(kuò)增‘粵紅1號(hào)’的帶型；第3、4泳道分別為L(zhǎng)0143和L0622的引物對(duì)擴(kuò)增‘匯豐1號(hào)’的帶型；第5、6泳道分別為L(zhǎng)0143和L0622的引物對(duì)擴(kuò)增‘匯豐2號(hào)’的帶型；第7、8泳道分別為L(zhǎng)0143和L0622的引物對(duì)擴(kuò)增‘匯豐5號(hào)’的帶型，每個(gè)品種都有其特異的帶型組合，能與其它3個(gè)品種區(qū)分。
【具體實(shí)施方式】
[0017]一種用于鑒定辣椒品種‘匯豐2號(hào)’種子純度的SSR分子標(biāo)記L0143，其定位于辣椒第1號(hào)染色體上，包括母本L0143-1和父本L0143-2，其大小分別為141bp和149bp。
[0018]優(yōu)選的，所述SSR分子標(biāo)記L0143，其母本L0143-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，父本L0143-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0019]用于PCR擴(kuò)增上述SSR分子標(biāo)記L0143的引物對(duì)。
[0020]優(yōu)選的，用于PCR擴(kuò)增SSR分子標(biāo)記L0143的引物對(duì)，其序列如下所示:
L0143F:ATGGAGCACCATACTCAAACAACC (SEQ ID N0.3)；
L0143R:GTTTACATCTCCCGACTGAAACTCCG (SEQ ID N0.4)。
[0021]一種用于鑒定辣椒品種‘匯豐2號(hào)’種子純度的SSR分子標(biāo)記L0622，其定位于辣椒第6號(hào)染色體上，包括母本L0622-1和父本L0622-2，其大小分別為196bp和208bp。
[0022]優(yōu)選的，所述SSR分子標(biāo)記L0622，其母本L0622-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，父本L0622-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0023]用于PCR擴(kuò)增上述SSR分子標(biāo)記L0622的引物對(duì)。
[0024]優(yōu)選的，用于PCR擴(kuò)增SSR分子標(biāo)記L0622的引物對(duì)，其序列如下所示:
L0622F:GCTCATCAACCCACCTTCATCA (SEQ ID N0.7)；
L0622R:ATGCGTTGTCCGAGTAGGGAAG (SEQ ID N0.8)。
[0025]一種利用SSR引物組鑒定辣椒品種‘匯豐2號(hào)’種子純度的方法，包括如下步驟:
(1)以待檢測(cè)辣椒幼苗基因組DNA為模板，使用上述L0143和/或L0622的SSR引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
(2)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)；如果產(chǎn)物中同時(shí)含有SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的條帶，或者同時(shí)含有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的條帶，則該辣椒樣品為‘匯豐2號(hào)’真雜種。
[0026]優(yōu)選的，步驟(1)中提取辣椒幼苗基因組DNA的方法為TPS法，步驟如下:
①將約200mg辣椒幼苗葉片放入2.0ml離心管中，每個(gè)管中插一根塑料研磨棒，用長(zhǎng)柄鑷子夾住在液氮中速凍約30s后快速研磨成粉末，