新的RhtB蛋白變體和使用其產(chǎn)生O-磷酸絲氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)的輸出0-磷酸絲氨酸（OPS)能力的RhtB (高絲氨酸/高絲 氨酸內(nèi)酯輸出運(yùn)載體）蛋白變體--所述〇-磷酸絲氨酸是L-半胱氨酸的前體、編碼所述 蛋白質(zhì)的多核苷酸、包含所述多核苷酸的載體、包含所述蛋白變體的產(chǎn)OPS微生物、使用所 述微生物產(chǎn)生0-磷酸絲氨酸的方法、和制備半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括使通過產(chǎn) OPS的方法產(chǎn)生的0-磷酸絲氨酸與硫化物在0-磷酸絲氨酸硫化氫解酶（OPSS)或表達(dá)OPSS 的微生物的存在下反應(yīng)。
【背景技術(shù)】
[0002] L-半胱氨酸一一在所有生物體中的硫代謝中起重要作用的氨基酸，不僅用于合成 生物蛋白，比如毛發(fā)角蛋白、谷胱甘肽、生物素、蛋氨酸和其它含硫代謝產(chǎn)物，而且還作為用 于生物合成輔酶A的前體。
[0003] 使用微生物產(chǎn)生L-半胱氨酸的已知方法包括使用微生物將D，L-ATC生物轉(zhuǎn)化為 L-半胱氨酸（Ryu OH 等人，Process Biochem.，32:201-209, 1997)。另一個(gè)已知方法是通 過使用大腸桿菌的直接發(fā)酵產(chǎn)生L-半胱氨酸（EP 0885962B;Wada M Micrbiol. Biochem.，73:48-54, 2006)。同時(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在某些微生物中從0-磷酸絲 氨酸（OPS)合成L-半胱氨酸的酶（0-磷酸絲氨酸硫化氫解酶（OPSS))?；诖税l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明 人開發(fā)了通過培養(yǎng)突變微生物以積累其中的0PS，從而通過使OPS與OPSS酶反應(yīng)產(chǎn)生半胱 氨酸的方法（韓國(guó)專利公開公布號(hào)10-2012-004111)。為了在高產(chǎn)率下產(chǎn)生半胱氨酸，仍存 在產(chǎn)生過量的OPS的需要。因此，本發(fā)明人已經(jīng)做了廣泛的努力以發(fā)現(xiàn)使在產(chǎn)OPS菌株中產(chǎn) 生的〇-磷酸絲氨酸能夠從細(xì)胞順利地釋放的適當(dāng)?shù)妮敵鲞\(yùn)載體（exporter)。此外，基于各 種類型的已知的運(yùn)載體，本發(fā)明人篩選了編碼〇-乙酰絲氨酸/半胱氨酸外排蛋白（efflux protein)的ydeD、編碼0-乙酰絲氨酸/半胱氨酸輸出透性酶的yfiK (Franke I、Resch A、 Dassler T 和 Bock A，J. Bacteriology, 185:1161-166, 2003)、編碼高絲氛酸 / 高絲氛酸內(nèi) 酯外排蛋白的 rhtB(Zakataeva NP、Aleshin VV、Tokmakova IL、Troshin PV、Livshits VA， FEBS Lett 1999 ;452 (3) ;228-32)等，并且特別發(fā)現(xiàn)產(chǎn)OPS菌株中RhtB的增強(qiáng)導(dǎo)致OPS濃 度增大（韓國(guó)專利公開公布號(hào)10-2012-004115)。然而，為了產(chǎn)生更高產(chǎn)率的半胱氨酸，仍 需要開發(fā)具有從產(chǎn)OPS菌株輸出前體OPS的更高能力的運(yùn)載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 技術(shù)問題
[0005] 本發(fā)明人已經(jīng)做了廣泛的努力以發(fā)現(xiàn)具有增大的OPS輸出活性的RhtB蛋白變體 以便能夠進(jìn)一步增大OPS的產(chǎn)生，結(jié)果，已經(jīng)識(shí)別具有增大的OPS輸出活性的四個(gè)新的RhtB 蛋白變體，并且已發(fā)現(xiàn)所述蛋白質(zhì)可更有效地從產(chǎn)OPS菌株輸出0PS，從而完成本發(fā)明。
[0006] 解決問題的方案
[0007] 本發(fā)明的目的是提供具有增強(qiáng)的0-磷酸絲氨酸（OPS)輸出活性的RhtB(高絲氨 酸/高絲氨酸內(nèi)酯輸出運(yùn)載體）蛋白變體。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼所述蛋白變體的多核苷酸和包含所述多核苷酸 的載體。
[0009] 本發(fā)明的又另一個(gè)目的是提供包含所述蛋白變體的產(chǎn)OPS微生物。
[0010] 本發(fā)明的又另一個(gè)目的是提供用于產(chǎn)生OPS的方法，其包括培養(yǎng)微生物。
[0011] 本發(fā)明的又另一個(gè)目的是提供用于產(chǎn)生半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括使通 過用于產(chǎn)生〇-磷酸絲氨酸的上述方法產(chǎn)生的〇-磷酸絲氨酸與硫化物在〇-磷酸絲氨酸硫 化氫解酶（OPSS)或表達(dá)OPSS的微生物的存在下反應(yīng)。
[0012] 發(fā)明的有利效果
[0013] 本發(fā)明的RhtB蛋白變體與野生型RhtB蛋白相比具有卓越的OPS輸出活性，并且 因而當(dāng)?shù)鞍鬃凅w應(yīng)用于產(chǎn)〇-磷酸絲氨酸微生物時(shí)，可在微生物中高效地產(chǎn)生〇-磷酸絲氨 酸。
【附圖說明】
[0014] 圖1是顯示通過積累來自生物合成的0-磷酸絲氨酸和微生物發(fā)酵0-磷酸絲氨酸 及將積累的〇-磷酸絲氨酸酶促地轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-半胱氨酸從而產(chǎn)生L-半胱氨酸的方法的示意 圖。
[0015] 發(fā)明【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明的方面包括具有增強(qiáng)的0-磷酸絲氨酸輸出活性的RhtB (高絲氨酸/高絲 氨酸內(nèi)酯輸出運(yùn)載體）蛋白變體。
[0017] 如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"0-磷酸絲氨酸（以下描述為"0PS"）"是指絲氨酸和磷酸的 酯，即許多蛋白質(zhì)的組分。所述OPS是L-半胱氨酸的前體并可通過在OPS硫化氫解酶（以 下描述為"0PSS"）的催化作用下與硫化物反應(yīng)轉(zhuǎn)化為半胱氨酸。因此，在半胱氨酸的產(chǎn)生 中增大OPS的生產(chǎn)力是重要的因素，并且因而需要開發(fā)使胞內(nèi)OPS能夠有效地從產(chǎn)OPS菌 株分泌的運(yùn)載體。
[0018] 如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"RhtB(高絲氨酸/高絲氨酸內(nèi)酯輸出運(yùn)載體）蛋白變體"已知 為高絲氨酸/高絲氨酸內(nèi)酯的輸出運(yùn)載體，即蘇氨酸的前體。可從已知的數(shù)據(jù)庫(kù)比如NCBI GenBank獲得關(guān)于RhtB蛋白的信息。例如，它可以是在登錄號(hào)AAT48223(EG11469)下存儲(chǔ) 的蛋白質(zhì)，并且其氨基酸序列可以在SEQ ID NO :1中陳述。
[0019] 如本文使用的，表述"具有增強(qiáng)的0-磷酸絲氨酸輸出活性的RhtB(高絲氨酸/高 絲氨酸內(nèi)酯輸出運(yùn)載體）蛋白變體"是指與野生型RhtB蛋白相比具有增強(qiáng)的OPS輸出活性 的蛋白質(zhì)，并且其包含野生型RhtB蛋白的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變。具體地， 具有增強(qiáng)的OPS輸出活性的四個(gè)RhtB蛋白變體是通過在編碼RhtB蛋白的多核苷酸中誘導(dǎo) 隨機(jī)突變被識(shí)別的。在被識(shí)別的蛋白變體中，具有SEQ ID NO : 2的氨基酸序列的蛋白變體 標(biāo)為" RhtB ml"；具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的RhtB蛋白變體標(biāo)為" RhtB m2"；具有 SEQ ID NO :4的氨基酸序列的RhtB蛋白變體標(biāo)為"RhtB m3";和具有SEQ ID NO :5的氨基 酸序列的RhtB蛋白變體標(biāo)為" RhtB m4 "。
[0020] 本發(fā)明的RhtB蛋白變體不僅包括具有如SEQ ID NO :2、3、4或5中陳述的氨基酸 序列的蛋白質(zhì)，而且包括以下蛋白質(zhì)，其具有與SEQ ID NO :2、3、4或5的氣基酸序列相比， 顯示至少70%、具體至少80%、更具體至少90%、甚至更具體至少95%、還甚至更具體至少 98%、和最具體至少99%的同源性的氨基酸序列，并且具有與野生型RhtB蛋白質(zhì)相比基本 上增強(qiáng)的O-磷酸絲氨酸輸出活性。此外，只要其包含具有上述同源性的氨基酸序列并具有 基本上等同或相當(dāng)于RhtB蛋白的生物活性，包含RhtB蛋白的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨 基酸缺失、修飾、替換或添加的蛋白質(zhì)也明顯地包括進(jìn)本發(fā)明的范圍中。
[0021] 如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"同源性"是指兩個(gè)多核苷酸或多肽等份之間的同一性百分 比?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知技術(shù)確定從一種形式到另一種形式的序列之間的對(duì)應(yīng)。例如，可 以通過比對(duì)序列信息和使用可容易獲得的計(jì)算機(jī)程序，進(jìn)而通過直接比較兩個(gè)多肽分子或 多核苷酸分子之間的序列信息確定同源性。可選地，可通過以下方法確定同源性：在同源區(qū) 之間形成穩(wěn)定雙鏈體的條件下使多核苷酸雜交，接著使用單鏈特異性核酸酶消化，并且對(duì) 消化的片段進(jìn)行大小測(cè)定。
[0022] 如本文使用的，所有其語(yǔ)法形式和拼寫變化的術(shù)語(yǔ)"同源的"是指具有"共同進(jìn)化 起源"的蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，包括來自超家族的蛋白質(zhì)和來自不同物種的同源蛋白。這樣的 蛋白質(zhì)（和它們的編碼基因）具有序列同源性，如由它們高度的序列相似性所反映的。然 而，在常見使用和本發(fā)明中，當(dāng)被形容詞比如"非常高"修飾時(shí)，術(shù)語(yǔ)"同源的"可以是指序 列相似性而非共同進(jìn)化起源。
[0023] 如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"序列相似性"是指蛋白質(zhì)的核酸序列或氨基酸序列之間的同 一性或?qū)?yīng)的程度，所述蛋白質(zhì)可以或不可以共有共同進(jìn)化起源。在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)至 少大約21 % (具體至少大約50 %，和最具體至少大約75 %、90 %、95 %、96 %、97 %或99 % ) 的多肽在氨基酸序列的限定長(zhǎng)度上匹配時(shí)，兩個(gè)氨基酸序列是"基本上同源的"或"基本上 相似的"。可以通過使用序列數(shù)據(jù)庫(kù)