肽及其結(jié)合伴侶的制作方法
【專利說明】肽及其結(jié)合伴侶
[0001] 本發(fā)明涉及選自特定類型的肽和其結(jié)合伴侶例如抗體的部分，其在診斷和治療中 具有應(yīng)用。在診斷和治療中以及在用于篩選治療化合物的過程中使用這些部分的方法也為 本發(fā)明的一部分。分離的肽和其特異性結(jié)合伴侶為新型的并且形成本發(fā)明進(jìn)一步的方面。
[0002] 發(fā)明背景 念珠菌種屬為最常見的人類真菌病原體和口腔、胃腸道以及陰道念珠菌病的致病劑， 其在全世界引起數(shù)百萬個(gè)體中嚴(yán)重發(fā)病。陰道念珠菌病在生育年齡期間感染~75%的婦女 至少一次，等于~三千萬次感染發(fā)作/年（超過結(jié)核病3倍，超過HIV8倍：WHO 2007)。念珠 菌屬感染還是第三常見的醫(yī)院-獲得性血流感染，使念珠菌種屬在醫(yī)學(xué)上與大部分細(xì)菌感 染包括腸球菌05： cWi)和假單胞菌種屬相比更重要。全身性念珠菌病是致命的（30-50% 的死亡率），念珠菌血癥每年有~300, 000病例，等于~100, 000死亡/年。此外，念珠菌屬 感染是HIV感染最常見的口腔表現(xiàn)，50%的HIV+患者和90% AIDS患者患有口腔念珠菌病。 每年有~4百萬HIV病例，這等于~2百萬口腔念珠菌病病例/年。實(shí)際上，免疫受損群體的 最大殺手之一為真菌感染。在美國(guó)，每年對(duì)真菌感染的衛(wèi)生保健費(fèi)用為$26億，其中念珠菌 屬感染占$18億。EU衛(wèi)生保健費(fèi)用估計(jì)會(huì)類似。因此，念珠菌屬病原體攜帶巨大的健康負(fù) 荷并且代表全球社區(qū)的主要的社會(huì)-經(jīng)濟(jì)挑戰(zhàn)。
[0003] 白色念珠菌為正常人微生物組的一員。盡管通常為口腔、胃腸道和泌尿生殖道的 共生體，白色念珠菌也是淺表感染例如陰道炎非常常見的原因。此外，普通醫(yī)源性程序，例 如胃腸道手術(shù)、中心靜脈導(dǎo)管植入或抗生素治療為散播念珠菌病的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。此種形 式的全身性念珠菌病目前是醫(yī)院血流感染的第三常見原因，并且念珠菌屬所導(dǎo)致的嚴(yán)重?cái)?血癥的死亡率在一些患者群中超過50%。
[0004] 鑒定新的刺激保護(hù)性宿主免疫的上皮和真菌靶將最終對(duì)全球健康具有重要含義。
[0005] 白色念珠菌毒力依賴于許多因素，包括形態(tài)可塑性、粘附素和侵襲素的表達(dá)、穩(wěn)健 的應(yīng)激反應(yīng)、免疫逃避、代謝靈活性和營(yíng)養(yǎng)獲取。然而，白色念珠菌如何導(dǎo)致?lián)p傷仍然不清 楚。
[0006] 認(rèn)為白色念珠菌損傷宿主的機(jī)制是多因素的，并且推測(cè)其依賴于粘附、侵入、菌絲 延伸、膨壓和分泌水解酶的組合。盡管長(zhǎng)期以來假定白色念珠菌產(chǎn)生毒素并且白色念珠菌 菌絲的培養(yǎng)上清證明顯示溶血活性，白色念珠菌溶解宿主細(xì)胞的能力的潛在的機(jī)制尚難以 捉摸。然而，清楚的是，菌絲對(duì)于粘附、侵入和損傷而言是必不可少的。因此，損傷由菌絲和 /或菌絲相關(guān)因素導(dǎo)致。
[0007] 由于其在菌絲形成期間提高的表達(dá)，基因儀￡7 (細(xì)胞伸長(zhǎng)程度1)在二十年前首 先被鑒定出來。然而，儀$7的缺失不影響白色念珠菌中的菌絲形成并且尚未報(bào)道過白色念 珠菌野生型和儀$7缺失菌株之間的表型差異。盡管如此，儀$7表達(dá)已在多個(gè)獨(dú)立研究中 用作菌絲形成的標(biāo)志物并且儀$7為菌絲形成期間表達(dá)最強(qiáng)的基因之一。事實(shí)上，儀$7在 核心菌絲相關(guān)基因的小群體內(nèi)。先前已報(bào)道重組Ecel被蛋白酶，Kex2,在賴氨酸/精氨酸 殘基處加工。然而，從未顯示過Ecel的功能。
[0008] 當(dāng)前，用于治療真菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)為使用抗真菌藥物，此類藥物主要靶向細(xì)胞壁 (棘球白素）、細(xì)胞膜（聚烯類）或麥角固醇合成（唑系）。然而，念珠菌屬感染的持續(xù)增加 以及越來越多的藥物抗性突顯了對(duì)發(fā)現(xiàn)新的和更好的劑的需要，所述劑靶向：（i)識(shí)別并 通常將這些潛在的威脅生命的病原體限制于粘膜表面的上皮過程或（ii)促進(jìn)感染和/或 介導(dǎo)免疫激活和保護(hù)性免疫的真菌決定簇。盡管如此，尚無用于對(duì)抗念珠菌屬感染的疫苗 候選物或基于-免疫的干預(yù)策略。同樣，尚無特異性靶向粘膜真菌感染的市售藥物。
[0009] 發(fā)明概沐 本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)Ecel在宿主細(xì)胞激活和損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如儀￡7缺失使白色念 珠菌不能損傷或激活人上皮細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)這一事實(shí)所證明。此外，本申請(qǐng)人已經(jīng)證明 Ecel蛋白酶解加工的單肽產(chǎn)物起肽毒素，特別是，穿孔毒素作用：其為在人真菌病原體中 第一個(gè)如此描述的。通過靶向該單肽有可能防止兩種宿主損傷（真菌驅(qū)使）和操縱免疫誘 導(dǎo)保護(hù)（宿主驅(qū)使）。迄今為止，無其它念珠菌屬蛋白顯示這些表型并且無其它方法可處理 真菌和宿主方面二者。
[0010] 這產(chǎn)生了該肽和其特異性結(jié)合伴侶以及發(fā)現(xiàn)和開發(fā)靶向該特異性肽的抗真菌化 合物的許多診斷和治療應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的第一個(gè)方面提供任選標(biāo)記的包含SEQ ID NO 1的肽： SIIGIIMGILGNIPQVIQIIMSIVKAFKGNKR (SEQ ID NO. 1) 或其變體，或這些中任一的免疫原性片段；或其標(biāo)記形式。
[0012] 如本文所使用的，表述"變體"是指其中氨基酸序列與SEQ ID NO 1的序列不同的 肽序列，因?yàn)樵撔蛄袃?nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被其它氨基酸置換。然而，變體產(chǎn)生與SEQ ID NO 1相似的生物學(xué)作用。具體而言，任何變體會(huì)與表面受體EGFR (表皮生長(zhǎng)因子受體）相 互作用以引起免疫應(yīng)答和/或免疫球蛋白的激活，并且特別地響應(yīng)所述變體產(chǎn)生的抗體會(huì) 與SEQ ID NO 1交叉反應(yīng)?；蛘呋虼送猓鲎凅w會(huì)在宿主細(xì)胞中，例如通過起穿孔劑作用， 誘導(dǎo)損傷。
[0013] 當(dāng)氨基酸被具有廣泛相似性質(zhì)的同一類別中的不同氨基酸代替時(shí)氨基酸置換可 視為"保守的"。非-保守置換為其中氨基酸被不同類型或類別的氨基酸代替。
[0014] 氨基酸類別定義如下： 類另丨丨 氨基酸實(shí)例 非極性： A、V、L、I、P、M、F、W 不帶電極性： G、S、T、C、Y、N、Q 酸性： D、E 堿性： K、R、H 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的，通過保守性置換改變肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)可能不顯著改變?cè)撾?的活性，這是因?yàn)椴迦胄蛄械陌被岬膫?cè)鏈可能能夠形成與被置換出的氨基酸的側(cè)鏈相似 的鍵和接觸。甚至當(dāng)置換在決定該肽構(gòu)象的關(guān)鍵性區(qū)域中時(shí)亦是如此。
[0015] 非-保守性置換也可為可能的，條件是這些置換不妨礙該肽的功能，特別是其同 與SEQ ID NO 1反應(yīng)的免疫球蛋白交叉反應(yīng)的能力。
[0016] 一般來說，較少的非-保守性置換會(huì)有可能不改變多肽的生物學(xué)活性。
[0017] 具體的變體可包括白色念珠菌中編碼SEQ ID NO 1的肽的基因序列的直系同源物 或旁系同源物所編碼的肽。具體的變體序列為如下文圖2中所示的來自都柏林念珠菌 i/i/yWiflieftsis)和熱帶念珠菌（C 的直系同源物。
[0018] 一般而言，變體會(huì)具有會(huì)與SEQ ID NO 1至少70%，例如至少71%、75%、79%、81%、 84%、87%、90%、93%或96%的同一性的氨基酸序列。該語境中的同一性可使用^^3了？計(jì)算機(jī) 程序以SEQ ID NO 1作為基礎(chǔ)序列測(cè)定。該BLAST軟件在http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi (2009年3月12日可訪問）上公開可用。
[0019] 變體還可包含附加序列例如可用于例如方便肽的純化或其檢測(cè)的標(biāo)簽序列。因此 例如，變體可進(jìn)一步包含親和標(biāo)簽，例如如本領(lǐng)域已知的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白（CBP)、麥芽糖結(jié) 合蛋白（MBP)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST)、FLAG、myc、生物素或聚（His)標(biāo)簽。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，變體可包含熒光蛋白例如綠色熒光蛋白（GFP)。
[0020] 當(dāng)所述肽用于診斷或篩選抗真菌蛋白時(shí)，標(biāo)記該肽可為有幫助的，例如用化學(xué)標(biāo) 記如熒光或放射性標(biāo)記。廣泛范圍的此類標(biāo)記可市售獲得，但實(shí)例包括熒光素及衍生物 (例如熒光素異硫氰酸酯（FITC)、羧基熒光素琥珀酰亞胺酯、熒光素二氯三嗪（DTAF)和 6-羧基-4'，5'-二氯-2'，7'-二甲氧基熒光素（J0E))、羅丹明及衍生物例如羧基四 甲基羅丹明（TAMRA)、四甲基羅丹明（TMR)及其異硫氰酸酯衍生物（TRITC)、磺基羅丹明、德 克薩斯紅、羅丹明紅以及可以以商品名Alexa獲得的染料）。
[0021 ] 這些標(biāo)記可使用常規(guī)方法摻入所述肽中。
[0022] 如本文所使用的術(shù)語"片段"是指具有與SEQ ID NO 1共同的生物學(xué)功能（例如 誘導(dǎo)損傷、免疫調(diào)制或?yàn)槊庖咴缘?，例如表位片段）和與SEQ ID NO 1的特異性結(jié)合伴侶 反應(yīng)的SEQ ID NO 1的氨基酸序列的任何部分。片段可包含連接在一起的來自全長(zhǎng)蛋白內(nèi) 的一個(gè)以上的部分。部分會(huì)適當(dāng)?shù)匕辽?個(gè)并且優(yōu)選地至少10個(gè)來自基礎(chǔ)序列的連 續(xù)氨基酸。合適的片段會(huì)包括含有多至31個(gè)氨基酸的缺失突變體，例如至少7個(gè)氨基酸， 例如至少10個(gè)，例如至少15個(gè)，如至少20個(gè)，更合適地至少30個(gè)氨基酸。
[0023] 值得注意的是，Seq ID NO 1包含兩個(gè)含有具有高致淀粉樣變性（amyloidogenic) 潛能的序列的區(qū)段（加下劃線的），由于其疏水性質(zhì)和潛在形成α -螺旋的能力，所述兩個(gè) 區(qū)段可能涉及細(xì)胞相互作用和激活。SEQ ID NO 1的具體變體或片段會(huì)包含至少一個(gè)在下 文分別表示為SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的所述序列。
[0024] IIGIIMGIL (SEQ ID NO. 2) QVIQIIMSIV (SEQ ID NO. 3) 然而在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述肽為SEQ ID NO. 1的肽。所述肽為分離或純化的 形式并且特別是不含至少一些并優(yōu)選所有可通過Kex2蛋白酶切割白色念珠菌的Ece 1蛋白 獲得的其它肽。盡管所述肽可從經(jīng)受Kex2蛋白酶消化的白色念珠菌分離，在具體的實(shí)施方 案中，該肽使用常規(guī)