具有高含量的Abu、γ-Glu-Abu和/或γ-Glu-Abu-Gly的酵母的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001] 本發(fā)明涉及具有高含量的Abu、γ -Glu-Abu和/或γ -Glu-Abu-Gly的酵母和酵母提取 物。所述酵母和酵母提取物在例如調(diào)味料和保健食品的食品領(lǐng)域有用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙酰乳酸合酶已知為催化由兩分子的丙酮酸生成乙酰乳酸和(：02的反應(yīng)和由丙酮 酸和α-丁酮酸（α-ΚΒ)生成α-乙酰羥基丁酸和CO 2的反應(yīng)的酶。已知/ZFi和/Z附為 編碼酵母的乙酰乳酸合酶的基因，且iZFi和/Z附分別編碼催化亞基和調(diào)節(jié)亞基。
[0003] 已知若乙酰乳酸合酶從細(xì)菌中缺失，則α-ΚΒ在細(xì)胞中的蓄積量增加（非專利文 件1)。
[0004] 還已知若抑制編碼乙酰乳酸合酶的71_因，特別是對于啤酒酵母特征性的 _因在釀造酵母中的表達(dá)量，則連位二酮，特別是二乙酰二酮的生產(chǎn)量增加，其 中二酮起到產(chǎn)品的異味的作用（專利文件1)。
[0005] α -氨基丁酸（Abu)由a-KB通過氨基轉(zhuǎn)移酶的作用生成。因此，通過增強(qiáng)參與 Abu的生物合成的酶的活性，例如α - 丁酮酸合成酶和氨基轉(zhuǎn)移酶的活性，可增加 Abu或 γ -Glu-Abu在細(xì)胞中的蓄積量（專利文件2)。
[0006] 但是，乙酰乳酸合酶活性和Abu、γ -Glu-Abu和/或γ -Glu-Abu-Gly在細(xì)胞中的 蓄積量之間的任何關(guān)系均是未知的。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)參考 專利文件 專利文件1:日本專利公開（Kohyo)No. 2009-527218 專利文件 2: W02012/046731。
[0008] 非專利文件 非專利文件 I: Bioessays, (3): I25-I3O (I987)0 [0009] 發(fā)明概述 通過本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的目的 本發(fā)明的目的是提供具有高含量的Abu、γ -Glu-Abu和/或γ -Glu-Abu-Gly的酵母和 酵母提取物。
[0010] 實(shí)現(xiàn)所述目的的手段 本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了各種研究以實(shí)現(xiàn)前述的目的。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)通過降低酵母 中乙酰乳酸合酶的活性，其中酵母的Ct-丁酮酸合成酶和氨基轉(zhuǎn)移酶的活性增強(qiáng)，Abu、 γ -Glu-Abu和γ -Glu-Abu-Gly在酵母細(xì)胞中的蓄積量增加，從而完成了本發(fā)明。
[0011] 因而，可如下具體化本發(fā)明。
[0012] [1] 酵母，其具有高含量的α-氨基丁酸（Abu)-相關(guān)的化合物，其中酵母經(jīng)修飾以使得胞 內(nèi)乙酰乳酸合酶活性降低， 其中所述Abu-相關(guān)的化合物由選自Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly的一種或更 多種化合物組成。
[0013] [2] 根據(jù)[1]所述的酵母，其經(jīng)進(jìn)一步修飾以使得選自α - 丁酮酸合成酶和氨基轉(zhuǎn)移酶的 一種或更多種酶的活性增加。
[0014] [3] 根據(jù)[2]所述的酵母，其中所述α-丁酮酸合成酶是由基因編碼的酶。
[0015] [4] 根據(jù)[2]所述的酵母，其中所述氨基轉(zhuǎn)移酶是由似77基因編碼的酶。
[0016] [5] 根據(jù)[1]至[4]中任一項(xiàng)所述的酵母，其經(jīng)進(jìn)一步修飾以使得γ-谷氨酰半胱氨酸合 成酶活性增加。
[0017] [6] 根據(jù)[1]至[5]中任一項(xiàng)所述的酵母，其為酵母菌屬酵母yeast」或 假絲酵母菌屬酵母yeast人
[0018] [7] 根據(jù)[6]所述的酵母，其為釀酒酵母（/&^1^(3/'<9^^ 1?6>6106^6>1^6^(36>/)或產(chǎn)骯假絲酵母 {Candida 。
[0019] [8] 用于生產(chǎn)酵母提取物的方法，所述方法包括通過使用根據(jù)[1]至[7]中任一項(xiàng)所述的 酵母作為原材料來制備酵母提取物。
[0020] [9] 用于生產(chǎn)Abu-相關(guān)的化合物的方法，所述方法包括： 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)[1]至[7]中任一項(xiàng)所述的酵母；和 從培養(yǎng)物中收集所述Abu-相關(guān)的化合物。
[0021] [10] 根據(jù)[9]所述的方法，其中所述Abu-相關(guān)的化合物是γ-Glu-Abu和/或 γ-Glu-Abu-Gly0
[0022] 附圖簡述
[圖1]圖1是顯示當(dāng)將Μ007Υ株（親株）和Μ013Υ株（/ZC啟動子置換株）各自在 SD培養(yǎng)基中培養(yǎng)時觀察到的/ZC mRNA表達(dá)量的圖表。數(shù)據(jù)顯示為/ZC mRNA的量與作為 內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的JiTV mRNA的量的比例。
[0023] [圖2]圖2是顯示當(dāng)將M007Y株（親株）和M013Y株（/ZC啟動子置換株）各 自在SD培養(yǎng)基中培養(yǎng)時觀察到的Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly在細(xì)胞中的含量的 圖表。數(shù)據(jù)顯示為基于干燥細(xì)胞重量的化合物的含量（Mfflol/g-DCW)。在圖表中，黑色部分 顯示γ -Glu-Abu含量，斜線部分顯示Abu含量，及灰色部分顯示γ -Glu-Abu-Gly含量。
[0024] [圖3]圖3是顯示當(dāng)將Μ007Υ株、Μ013Υ株和Μ014Υ株（/ZFi破壞株）各自在含 有異亮氨酸和纈氨酸的SD培養(yǎng)基中培養(yǎng)時觀察到的/ZC mRNA表達(dá)量的圖表。數(shù)據(jù)顯示 為/ZC mRNA的量與作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的M77 mRNA的量的比例。
[0025] [圖4]圖4是顯示當(dāng)將M007Y株、M013Y株和M014Y株（/ZFi破壞株）各自在含 有異亮氨酸和纈氨酸的SD培養(yǎng)基中培養(yǎng)時觀察到的Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly 在細(xì)胞中的含量的圖表。數(shù)據(jù)顯示為基于干燥細(xì)胞重量的化合物的含量（Mm〇l/g-DCW)。 在圖表中，黑色部分顯示γ-Glu-Abu含量，斜線部分顯示Abu含量，及灰色部分顯示 γ -Glu-Abu-Gly 含量。
[0026] [圖5]圖5是顯示當(dāng)將Μ007Υ株、Μ013Υ株和Μ014Υ株（/ZFi破壞株）各自在含 有異亮氨酸和纈氨酸的SDTE培養(yǎng)基中培養(yǎng)時觀察到的Abu、γ -Glu-Abu和γ -Glu-Abu-Gly 在細(xì)胞中的含量的圖表。數(shù)據(jù)顯示為基于干燥細(xì)胞重量的化合物的含量（Mm〇l/g-DCW)。 在圖表中，黑色部分顯示γ-Glu-Abu含量，斜線部分顯示Abu含量，及灰色部分顯示 γ -Glu-Abu-Gly 含量。
[0027] [圖6]圖6是顯示當(dāng)將Υ006Υ株（親株）和Μ015Υ株（/ZFi破壞株）各自在含 有異亮氨酸和纈氨酸的SD培養(yǎng)基中培養(yǎng)時觀察到的Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly 在細(xì)胞中的含量的圖表。數(shù)據(jù)顯示為基于干燥細(xì)胞重量的化合物的含量（Mm〇l/g-DCW)。 在圖表中，黑色部分顯示γ-Glu-Abu含量，斜線部分顯示Abu含量，及灰色部分顯示 γ -Glu-Abu-Gly 含量。
[0028] [圖7]圖7是顯示當(dāng)將Υ006Υ株（親株）和Μ015Υ株（71?皮壞株）各自在含 有異亮氨酸和纈氨酸的SDTE培養(yǎng)基中培養(yǎng)時觀察到的Abu、γ -Glu-Abu和γ -Glu-Abu-Gly 在細(xì)胞中的含量的圖表。數(shù)據(jù)顯示為基于干燥細(xì)胞重量的化合物的含量（Mm〇l/g-DCW)。 在圖表中，黑色部分顯示γ-Glu-Abu含量，斜線部分顯示Abu含量，及灰色部分顯示 γ -Glu-Abu-Gly 含量。
[0029] 實(shí)施本發(fā)明的方式 以下將詳細(xì)地解釋本發(fā)明。
[0030] 〈1>本發(fā)明的酵母 〈1-1>本發(fā)明的酵母 本發(fā)明的酵母是具有高含量的Ct-氨基丁酸（AbU)-相關(guān)的化合物的酵母，其中酵母經(jīng) 修飾以使得胞內(nèi)乙酰乳酸合酶活性降低。
[0031] 在本發(fā)明中，"Abu-相關(guān)的化合物"指選自Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly的 化合物。在本發(fā)明中，Abu和Glu是L-異構(gòu)體。
[0032] 表述〃具有/含有高含量的Abu-相關(guān)的化合物〃意指當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明 的酵母時，所述酵母在其細(xì)胞中以使得所述化合物可被檢測到的程度產(chǎn)生并蓄積Abu-相 關(guān)的化合物。本發(fā)明的酵母可為能夠以比對于非修飾株觀察到的更大的量在細(xì)胞中蓄積 Abu-相關(guān)的化合物的酵母。非修飾株的實(shí)例包括酵母的野生株和親株。本發(fā)明的酵母可為 能夠以0. 4 Mmol/g-DCW或更多、I Mmol/g-DCW或更多、2 Mmol/g-DCW或更多、3 Mmol/g-DCW 或更多、5 Mmol/g-DCW或更多、或10 Mmol/g-DCW或更多的量在細(xì)胞中蓄積Abu-相關(guān)的化 合物的酵母。在本發(fā)明中，可產(chǎn)生并蓄積一種Abu-相關(guān)的化合物，或可產(chǎn)生并蓄積兩種或 更多種Abu-相關(guān)的化合物。
[0033] 可通過修飾酵母的適當(dāng)?shù)木辏?，之后提到的任何菌株來獲得本發(fā)明的酵母。
[0034] 本發(fā)明的酵母可為芽殖酵母或裂殖酵母。芽殖酵母的實(shí)例包括屬于酵母菌屬 的酵母，例如釀酒酵母，屬于假絲酵母菌屬的那些，例如產(chǎn)朊假絲酵母，屬于畢赤酵母屬 (Z3ZcAia)的那些，例如畢赤酵母（/3ZcAia 和屬于漢遜酵母屬（/feftse/wJa)的那 些，例如多形漢遜酵母（/fease/wJa 裂殖酵母的實(shí)例包括屬于裂殖酵母屬 的酵母，例如粟酒裂殖酵母jOoazAe)。在這 些當(dāng)中，優(yōu)選釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母，上述二者常常用于酵母提取物的生產(chǎn)。本發(fā)明的酵 母可為單倍體酵母，或可為二倍體酵母或更多的多倍體酵母。
[0035] 釀酒酵母的實(shí)例包括，例如，釀酒酵母Y006株（FERM BP-11299)。在2010年8 月18日將Y006株作為國際保藏物保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所，特許生物 保藏中心(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary)(目前是獨(dú)立行政法人，國家技術(shù)和評 估研究所，國際專利生物保藏中心（independent administrative agency, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary), #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japan)，并指定保藏號為FERM BP-11299。
[0036] 釀酒酵母的實(shí)例還包括，例如，釀酒酵母BY4743株（ATCC 201390)和釀酒酵母 S288C株（ATCC 26108)。作為產(chǎn)朊假絲酵母，也可使用例如產(chǎn)朊假絲酵母ATCC 22023株。 這些菌株可獲自，例如美國模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection)(地 址：12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852， Ρ·0· Box 1549， Manassas, VA 20108，United States of America)。即，賦予各菌株登記號，并可使用這些登記號來 訂購菌株（參考http://WWW. atcc. org/)。菌株的登記號列在美國模式培養(yǎng)物保藏所的目 錄中。
[0037] 〈1_2>乙酰乳酸合酶活性的降低 本發(fā)明的酵母已經(jīng)修飾以使得胞內(nèi)乙酰乳酸合酶活性降低。
[0038] 在本發(fā)明中，〃乙酰乳酸合酶〃指具有用于催化由丙酮酸和α - 丁酮酸（α -KB)生 成α -乙酰羥基丁酸和CO2的反應(yīng)的活性的蛋白（EC 2. 2. 1. 6)。該活性也稱作〃乙酰乳酸 合酶活性〃。在本發(fā)明中，乙酰乳酸合酶可具有，或可不具有用于催化由兩分子的丙酮酸生 成乙酰乳酸和CO 2的反應(yīng)的活性。可通過，例如，破壞編碼乙酰乳酸合酶的基因來降低乙酰 乳酸合酶活性。用于降低蛋白活性的方法的細(xì)節(jié)將在之后進(jìn)行描述。
[0039] 編碼乙酰乳酸合酶的基因的實(shí)例包括編碼乙酰乳酸合酶的催化亞基的iZ_ 因。由iZ_因編碼的蛋白也稱作Ilv2蛋白或Ilv2p。
[0040] 釀酒酵母的iZ^^2基因的核苷酸序列在酵母菌屬基因組數(shù)據(jù)庫（ Genome Database)中（ http://www.yeastgenome.org/)公開。釀酒酵母 S288C 株（ATCC 26108)的iZ_因?qū)?yīng)于在NCBI數(shù)據(jù)庫中登記為GenBank Accession NC_001145的染色 體XIII的序列中的484084至486147的序列。釀酒酵母S288C株（ATCC 26108)的Ilv2 蛋白登記為 GenBank Accession NP_013826。釀酒酵母 S288C 株（ATCC 26108)的 iZ_ 因的核苷酸序列和由該基因編碼的Ilv2蛋白的氨基酸序列分別顯示為SEQ ID NO: 15和 16。
[0041] 此外，例如，釀酒酵母Y006株（FERM BP-11299)具有兩個拷貝的iZ_因。
[0042] 可通過，例如，由非修飾的酵母和經(jīng)修飾的酵母制備粗酶溶液，并對比它們的乙酰 乳酸合酶活性來確認(rèn)乙酰乳酸合酶活性的降低?？赏ㄟ^，例如，已知的方法（F.C. Stormer 和 H.E. Umbarger, Biochem. Biophys. Res. Commun.，17，5，587-592 (1964))來測量 乙酰乳酸合酶活性。
[0043] 乙酰乳酸合酶可為前述的乙酰乳酸合酶，例如含有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列 的蛋白的變體，只要維持原始的功能。此類變體可稱作"保守變體"。保守變體的實(shí)例包括， 例如，前述的乙酰乳酸合酶，例如含有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的蛋白的同源物和經(jīng)人 工修飾的形式。
[0044] 表述"維持原始的功能"表示蛋白的變體具有對應(yīng)于原始蛋白的活性的活性。即， 用于乙酰乳酸合酶的表述"維持原始的功能"表示蛋白的變體具有乙酰乳酸合酶活性。
[0045] 編碼前述的乙酰乳酸合酶的同源物的基因可通過，例如，使用前述的編碼乙酰乳 酸合酶的基因的核苷酸序列作為查詢序列的BLAST檢索或FASTA檢索由公共數(shù)據(jù)庫容易地 獲得。此外，編碼前述的乙酰乳酸合酶的同源物的基因也可通過，例如，使用酵母的染色體 作為模板和基于已知的基因序列中的任何一個制備的寡核苷酸作為引物的PCR獲得。
[0046] 編碼乙酰乳酸合酶的保守變體的基因可為，例如，如下所述的這樣一種基因。艮口， 編碼乙酰乳酸合酶的基因也可為編碼具有前述的氨基酸序列的蛋白的基因，所述氨基酸序 列包括在