一種微生物解磷制劑及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物肥料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含解淀粉芽孢桿菌的菌劑及其制 備方法和在提高土壤中磷的利用上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 磷是植物生長所必需的礦質(zhì)元素之一，是植物體內(nèi)核酸及多種酶、輔酶、三磷酸腺 苷（ATP)等的重要組成部分，并以多種方式參與植物體內(nèi)的光合作用和生理生化過程，對(duì) 促進(jìn)植物的生長發(fā)育和新陳代謝具有重要作用。植物缺磷會(huì)影響核酸、蛋白質(zhì)合成，使細(xì)胞 形成和增殖受到抑制，導(dǎo)致生長發(fā)育停滯，根系發(fā)育不良，植物矮小，各類作物分蘗將減少 或延遲，抽穗推遲，開花晚，成熟遲，穗粒數(shù)減少，籽粒不飽滿，玉米果穗禿頂，馬鈴薯塊莖變 小等。因此，磷對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)來說是非常重要的。
[0003]自然界的磷庫主要存在于土壤中，其循環(huán)主要在土壤、植物和微生物之間進(jìn)行。土 壤作為植物磷素的供給源，其供磷水平的高低影響著植物的生長發(fā)育。土壤中的磷含有機(jī) 磷和無機(jī)磷兩種，有機(jī)磷占土壤全磷的1/3~1/2,主要以核酸、磷酸和植素存在。無機(jī)磷 占全磷的40%~75%，除少量可溶性磷酸鹽外，大部分為不溶性磷酸鹽（磷酸鈣、磷酸鐵、 鋁磷酸鹽等），這些形態(tài)的無機(jī)磷化物很難被植物吸收利用，土壤中能被植物直接吸收利用 的有效態(tài)磷僅占全磷的2%~3%。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界有43%的耕地土壤屬于缺磷土壤；我國 有74%的耕地土壤缺磷，土壤中95%以上的磷以穩(wěn)定的鋁硅酸鹽和磷灰石等為無效形式 存在，植物很難直接吸收利用，因此絕大多數(shù)農(nóng)作物及林木都要追施磷肥。施入的磷肥當(dāng) 季作物利用率為5%~25%，一部分磷肥隨雨水流入江河湖泊，造成水體的富營養(yǎng)化，引起 水質(zhì)污染；大部分磷由于土壤的固定作用，與土壤中的Ca' Fe' Fe' Al3+結(jié)合，形成難溶 性磷酸鹽，因此，大部分磷肥作為無效態(tài)（難溶態(tài)）在土壤中積累。由于長期施用磷肥，事 實(shí)上大多數(shù)農(nóng)田土壤潛在的磷庫含量很大，而且磷肥過多使用會(huì)造成土壤重金屬含量的增 加，土壤理化性質(zhì)改變，且有機(jī)磷農(nóng)藥的大量施用，造成環(huán)境污染，影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量，對(duì)人類 的健康帶來很大的危害。
[0004] 磷是許多發(fā)展中國家農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要限制因素，提高土壤中磷的利用效率將具 有重大意義。大量研究結(jié)果表明，某些微生物具有很強(qiáng)的解磷功能，通過其分泌物或吸收作 用可把土壤中無效態(tài)磷轉(zhuǎn)化成有效態(tài)磷，還分泌生長素等物質(zhì)刺激植物生長。解磷微生物 最直接的作用就是溶解土壤中的難溶性或不溶性磷素。解磷微生物肥料除了有提供作物可 吸收磷素以外還具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1)促進(jìn)農(nóng)作物對(duì)鋅、銅、鈣等其他營養(yǎng)元素的吸收。（2)增 強(qiáng)植物抗病能力。（3)肥效高。（4)減少環(huán)境污染。（5)解磷微生物肥料的生產(chǎn)工藝簡單， 投資少，見效快，效益好，具有極強(qiáng)的市場競爭力。因此，篩選解磷微生物，生產(chǎn)含有解磷功 能的微生物有機(jī)肥料對(duì)解決植物磷素供應(yīng)問題是一條很好的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在土壤中磷的利用效率較低，以及植 物的生長主要靠施用化肥、化學(xué)農(nóng)藥會(huì)帶來環(huán)境污染等缺陷，其發(fā)明的目的是通過一種微 生物解磷制劑分解土壤難溶無機(jī)磷，為植物提供可以直接吸收的磷素。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
[0007] 1. -種微生物解磷制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟：
[0008] (1)將解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)YN2010_KC CGMCC No. 5722活化后，按5~10 %接種量，將活化的所述解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No. 5722接種到種子培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度35°C、轉(zhuǎn)速 120rpm/min條件下，搖床培養(yǎng)24~36h，得到一級(jí)種子液，所述種子培養(yǎng)基由以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì) 的以下成分組成：葡萄糖 〇· 5 ~1%，（NH4)2SO4 0· 03 ~0· 05%，NaCl 0· 02 ~0· 03%，KCl 0· 02 ~0· 03%，Ca3(P04)2 0· 1 ~0· 2%，MgS04 ·7Η20 0· 02 ~0· 03%，MnS04 ·4Η20 0· 001 ~ 0· 003%，余量為水，pH 7· 0 ~7· 2 ;
[0009] (2)按10~12%接種量，將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接到種子罐內(nèi)的二級(jí)種子培養(yǎng)基，在 28~37°C，轉(zhuǎn)速100rpm/min，通氣量為1000L/h，罐壓保持在0. 01~0. 03MPa條件下培養(yǎng) 36~48h，得到二級(jí)種子液；所述二級(jí)種子培養(yǎng)基由以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)的以下成分組成：玉米 粉1. 5~3%，麩皮粉1~2%，酵母膏0. 05~0. 3%，蛋白胨0. 5~1 %，磷礦粉1~2%， MgSO4 · 7H20 0· 01 ~0· 03%，NaCl 0· 1 ~0· 3%，（NH4)2SO4 0· 03 ~0· 05%，余量為水，pH 7. 0 ~7. 2 ;
[0010] (3)按10~12 %接種量，將二級(jí)種子液接種到發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基，在28~ 37°C，轉(zhuǎn)速100rpm/min，通氣量為10000L/h、罐壓保持在0. 01~0. 03MPa條件下培養(yǎng)48~ 72h，培養(yǎng)后的發(fā)酵液中解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No. 5722的有效活菌數(shù)3 IX lO^fu/ml時(shí)，將發(fā)酵液用醫(yī)用塑料瓶包裝，即為所述微生物 解磷制劑，所述發(fā)酵培養(yǎng)基與步驟（2)所述二級(jí)種子培養(yǎng)基相同。
[0011] 2. -種微生物解磷制劑，其特征在于：它的活性成分為一株解淀粉芽孢桿菌 (Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No. 5722 的發(fā)酵液。
[0012] 3. -種微生物解磷制劑，其特征在于：所述生物解磷制劑通過技術(shù)方案1所述的 一種生物解磷制劑的制備方法制備得到。
[0013] 4.技術(shù)方案2或3所述的微生物解磷制劑在降解土壤難溶無機(jī)磷中的應(yīng)用。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0015] 1、本發(fā)明微生物解磷制劑通過本發(fā)明保藏號(hào)為CGMCC No. 5722的一株解淀粉芽孢 桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)YN2010_KC發(fā)酵而成的液體制劑，能提高土壤中難溶 性磷的生物有效性和土壤磷的利用率，節(jié)肥增產(chǎn)，改善土壤環(huán)境，能有效促進(jìn)植物包括農(nóng)作 物對(duì)土壤磷元素的吸收，分解作物根系周圍的難溶磷元素，可以作為降解土壤難溶無機(jī)磷 的解磷制劑。
[0016] 2、本發(fā)明微生物解磷制劑可作為微生物肥料，在生產(chǎn)中避免了 "三廢"污染，屬環(huán) 境友好型生物制劑，能減少環(huán)境污染并能修復(fù)土壤。
[0017] 3、本發(fā)明微生物解磷制劑的制備工藝簡單，成本低，施用方法簡單易行。
[0018] 本發(fā)明所述的解淀粉芽抱桿菌 Bacillus amyloliquefaciens YN2010-KC 于 2012 年1月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡稱：CGMCC)，保藏 號(hào)為CGMCC No. 5722,并于2012年1月12日檢測(cè)為存活。該普通微生物中心地址：中國北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編：100101。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明，各實(shí)施例無特殊說明為常規(guī)方法。
[0020] 實(shí)施例 1 本發(fā)明解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)YN2010_KC 的 獲得、鑒定和保臧
[0021] 1、本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌YN2010-KC的獲得
[0022] I. 1 材料
[0023] 采自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山農(nóng)場玉米根際周圍的土壤。
[0024] 1.2培養(yǎng)基制備
[0025] 將LB固體培養(yǎng)基和PSA培養(yǎng)基（馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基）融化，分別倒入滅菌培 養(yǎng)皿，冷卻，制成LB和PSA平板。
[0026] 1. 3分尚培養(yǎng)
[0027] 采用稀釋平皿分離法和平板劃線分離，將分離純化所得的一菌株命名為 YN2010-KC。
[0028] 2、解淀粉芽孢桿菌YN2010-KC的鑒定
[0029] 2. 1、形態(tài)學(xué)鑒定
[0030] 取菌株YN2010-KC在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)36小時(shí)，進(jìn)行形態(tài)觀察鑒定，菌 體為桿狀、端圓，周生鞭毛、具運(yùn)動(dòng)性，產(chǎn)生橢圓形芽孢；在LB和PSA平板上菌落圓形、淡 茶褐色、菌落中央顏色略深、隆起、表面干燥有褶皺。與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀 珠等編著，科學(xué)出版社，2001年）中描述的芽孢桿菌屬形態(tài)特征基本一致，初步判斷菌株 YN2010-KC 屬于芽抱桿菌（Bacillus spp.) 〇
[0031] 2. 2、生理生化鑒定
[0032] 菌株革蘭氏染色、芽孢染色、淀粉水解、葡萄糖利用、檸檬酸鹽利用、V-P反應(yīng)、接觸 酶反應(yīng)、硝酸鹽還原、明膠液化等均呈陽性。
[0033] 3、解淀粉芽孢桿菌YN2010-KC的保藏
[0034] 經(jīng)上述鑒定表明所分離獲得的菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)，其代號(hào)為YN2010-KC，所述的解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensYN2010_KC于2012年1月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心（簡稱：CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC No. 5722,并于2012年1月12日檢測(cè)為 存活。該普通微生物中心地址：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編：100101。
[0035] 實(shí)施例2本發(fā)明微生物解磷制劑的制備
[0036] 本發(fā)明生物解磷制劑的制備方法，包括以下步驟：
[0037] (1)將 _8〇°C保存的解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)YN2OlO-KC CGMCC No. 5722接種在液體LB培養(yǎng)基上，32°C培養(yǎng)24~36h，得活化的解淀粉芽孢桿菌 (Bacillus amyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No. 5722,按 10%接種量，將活化的所述 解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens) YN2010-KC CGMCC No. 572 接種到種子培 養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度35°C、轉(zhuǎn)速120rpm/min條件下，搖床培養(yǎng)36h，得到一級(jí)種子液，所述種子 培養(yǎng)基由以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)的以下成分組成：葡萄糖1%，（NH 4)2SO4 0. 05%，NaCl 0. 02%，KCl 0· 03 %，Ca3 (PO4) 20 · 2 %，MgSO4 · 7H20 0· 03 %，MnSO4 · 4H20 0· 003 %，余量為水，pH 7· O ~ 7. 2 ；
[0038] (2)按10%接種量，將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接到種子罐內(nèi)的二級(jí)種子培養(yǎng)基，在32°C，轉(zhuǎn) 速100rpm/min，通氣量為100