一種海參組織蛋白酶的真核表達方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物蛋白酶制備領(lǐng)域，尤其涉及一種海參組織蛋白酶的真核表達方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 原膠蛋白是機體組織的結(jié)構(gòu)蛋白，其諸多生理功能已被系統(tǒng)研究和廣泛認可。隨 著膠原蛋白產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，膠原蛋白酶解工藝中的關(guān)鍵生產(chǎn)要素一蛋白酶的需求也不斷 增長。目前較為常用的各類酶普遍存在膠原蛋白酶解效率不高的缺點，而運用基因工程技 術(shù)開發(fā)新型膠原蛋白酶可以彌補這一致命缺陷，且采用生物工程技術(shù)生產(chǎn)的膠原蛋白酶產(chǎn) 品品質(zhì)易控、生產(chǎn)成本低廉。刺參具有極強的自溶能力究其本質(zhì)即是組織細胞內(nèi)蛋白酶對 體壁組織蛋白（主要為膠原蛋白）的高效酶解作用。然而，有關(guān)刺參組織蛋白酶基因的篩 選、功能研究及相關(guān)蛋白酶產(chǎn)品開發(fā)卻尚未系統(tǒng)開展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種海參組織蛋白酶的真核表達方法， 通過該方法表達的海參蛋白酶具有生產(chǎn)成本低、品質(zhì)易控等特點，將增加膠原蛋白酶解蛋 白酶可選種類，提高酶解生產(chǎn)效益，具有重要的經(jīng)濟和社會價值。
[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種海參組織蛋白酶，該蛋白酶具有生產(chǎn)成本 低、品質(zhì)易控等特點。
[0005] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種海參組織蛋白酶的真核表達方 法，包括以下步驟：
[0006] (1)篩選組織蛋白酶基因 EST序列，以篩選出的片段序列為基礎(chǔ)，采用RACE全長克 隆方法獲取基因全長序列信息；
[0007] (2)通過全長序列信息預測分析編碼蛋白結(jié)構(gòu)特征及功能活性，查找確定關(guān)鍵結(jié) 構(gòu)域；
[0008] (3)根據(jù)預測分析結(jié)果，確定接入表達系統(tǒng)的基因序列片段；構(gòu)建宿主菌的真核 表達系統(tǒng)，體外表達目標蛋白；檢測并闡明表達獲得的蛋白酶活性功能特征。
[0009] 一種海參組織蛋白酶，根據(jù)上述一種海參組織蛋白酶的真核表達方法制備，其中 海參組織蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID :N0. 1所示。
[0010] 核苷酸序列SEQ ID :N0. 1如下：
[0011] CCAGACACTGTTGATTGGAGACCAAAGGGTTACGTCACTGGGGTCAAAGATCAGAAACAATGCGGATCC TGCTGGGCATTCAGCACCACTGGGTCACTTGAAGGTCAGATGTTCAACAAGACTGGTATGCTGGTCAGCTTGAGCGA ACAGAATCTCGTCGACTGCTCTCGTAAGGAGGGTAACATGGGTTGCCAAGGGGGGCTTATGGACGACGCCTTTCAAT ATGTCATTGATAACGGAGGTCTTGACACCGAGGATTGTTACCCGTACAAAGCCGTGCAAGGAACTTGCATGTACAAG TCGAGCTGCAACTCTGCTGATGTTGTCAAGTTCAACGATATTCCAACTGGTAACGAGATGGCACTTCAACAAGCTGT GGCTACCGTAGGACCTGTTTCTGTCGCCATAGACGCTGCTCTCAGTTCGTTCCATATGTACCATAGCGGTGTTTACG ATGACTCAATGTGCCGCAGCGACAGACAGCACTTGGATCACGGTGTGCTGGCGGTAGGTTACGGAACCATGGACGGG AAAGATTACTGGCTCGTTAAGAACAGCTGGGGCATGAGCTGGGGTGACCAGGGGTACATCATGATGTCTCGTAACAA GAACAACCAGTGTGGTATTGCAACTGCCGCCAGTTACCCAACTGTC
[0012] 本發(fā)明的有益效果是：通過該方法表達的海參蛋白酶具有生產(chǎn)成本低、品質(zhì)易控 等特點，將增加膠原蛋白酶解蛋白酶可選種類，提高酶解生產(chǎn)效益，具有重要的經(jīng)濟和社會 價值。
[0013] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進：
[0014] 進一步，步驟（1)中具體包括如下步驟：
[0015] 根據(jù)已獲得的刺參組織蛋白酶基因 EST序列片段，設計特異性全長克隆引物，采 用RACE技術(shù)擴增基因片段獲得功能基因的全長cDNA序列，通過NCBI網(wǎng)站及蛋白翻譯軟件 等初步分析cDNA序列的正確性。
[0016] 進一步，步驟（2)中具體包括如下步驟：
[0017] 查找確定刺參組織蛋白酶基因全長序列的開放閱讀框，確定編碼序列并推測編碼 蛋白的氨基酸序列，采用I 3DBSUM數(shù)據(jù)庫預測分析蛋白二級結(jié)構(gòu)、二硫鍵、配體結(jié)合位點等 結(jié)構(gòu)信息，PROCAT數(shù)據(jù)庫預測分析活性位點三維結(jié)構(gòu)，NRL-3D數(shù)據(jù)庫相似蛋白結(jié)構(gòu)分析， SMART蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域分析等，初步闡述基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)特征，明確結(jié)構(gòu)域位置。
[0018] 進一步，步驟（3)中具體包括如下步驟：
[0019] 根據(jù)已獲得的全長基因序列開放閱讀框信息序列信息，設計帶有HindIII和 EcoR I酶切位點的特異性引物，以刺參體壁cDNA為模版，擴增獲得目標序列；取擴增序列 克隆至PMD18-T載體中，獲得帶有目標克隆的載體后，采用HindIII和EcoR I雙酶切，獲取 目標克隆并連接至真核表達載體中，之后轉(zhuǎn)化到表達宿主菌中，分泌表達目標蛋白。
[0020] 進一步，所述步驟（1)中用TA克隆方法進行DNA片段克?。?br>[0021] 1)在微量離心管中配制下列DNA溶液，全量為5 μ 1 ;
[0022] 試劑使用量：
[0023] pMD? 18-TSimpleVector*l ：1 μ I ；
[0024] InsertDNA*3 :0· Ipmol ~0· 3pmol ;
[0025] dH20 :upto5 μ I ;
[0026] 2)向步驟I)中加入5μ1的Solution〗，在16°C中反應30min ;
[0027] 3)將步驟2)中得到的溶液加入至100 μ 1DH5 α感受態(tài)細胞中，冰中放置30分鐘；
[0028] 4)將步驟3)中得到的溶液在42°C加熱45秒鐘；
[0029] 5)將步驟4)中得到的溶液在冰中放置1分鐘；
[0030] 6)向步驟5)中得到的溶液加入800 μ ILB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60分鐘；
[0031 ] 7)在步驟6)中得到的溶液中取100 μ 1菌液涂至含有Amp的LB-瓊脂平板培養(yǎng)基 上培養(yǎng)，形成單菌落；
[0032] 8)在步驟7)中得到的單菌落中挑選單克隆，用含有Amp的LB-液體培養(yǎng)基培養(yǎng)并 送測序公司進行DNA序列檢測分析。
[0033] 進一步，所述的真核表達載體為pPIC9K載體；所述宿主菌為畢赤酵母表達菌株。
【具體實施方式】
[0034] 以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā) 明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0035] 實施例1
[0036] 一種海參組織蛋白酶的真核表達方法，包括將海參組織蛋白酶的核苷酸序列克隆 至真核表達載體中，轉(zhuǎn)化宿主細胞，進行誘導和表達的制備步驟，具體步驟如下：
[0037] (1)刺參組織蛋白酶基因全長克隆
[0038] 根據(jù)已獲得的刺參組織蛋白酶基因 EST序列片段，設計特異性全長克隆引物，采 用RACE技術(shù)擴增基因片段獲得功能基因的全長cDNA序列，通過NCBI網(wǎng)站及蛋白翻譯軟件 等初步分析cDNA序列的正確性。
[0039] (2)預測蛋白結(jié)構(gòu)分析并確定真核表達的基因片段
[0040] 查找確定刺參組織蛋白酶基因全長序列的開放閱讀框，確定編碼序列并推測編碼 蛋白的氨基酸序列，采用I 3DBSUM數(shù)據(jù)庫預測分析蛋白二級結(jié)構(gòu)、二硫鍵、配體結(jié)合位點等 結(jié)構(gòu)信息，PROCAT數(shù)據(jù)庫預測分析活性位點三維結(jié)構(gòu)，NRL-3D數(shù)據(jù)庫相似蛋白結(jié)構(gòu)分析， SMART蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域分析等，初步闡述基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)特征，明確結(jié)構(gòu)域位置。
[0041] 所確定的目標基因片段序列為：SEQ ID :N0. 1。
[0042] 核苷酸序列SEQ ID :Ν0· 1如下：
[0043] CCAGACACTGTTGATTGGAGACCAAAGGGTTACGTCACTGGGGTCAAAGATCAGAAACAATGCGGATCC TGCTGGGCATTCAGCACCACTGGGTCACTTGAAGGTCAGATGTTCAACAAGACTGGTATGCTGGTCAGCTTGAGCGA ACAGAATCTCGTCGACTGCTCTCGTAAGGAGGGTAACATGGGTTGCCAAGGGGGGCTTATGGACGACGCCTTTCAAT ATGTCATTGATAACGGAGGTCTTGACACCGAGGATTGTTACCCGTACAAAGCCGTGCAAGGAACTTGCATGTACAAG TCGAGCTGCAACTCTGCTGATGTTGTCAAGTTCAACGATATTCCAACTGGTAACGAGATGGCACTTCAACAAGCTGT GGCTACCGTAGGACCTGTTTCTGTCGCCATAGACGCTGCTCTCAGTTCGTTCCATATGTACCATAG