一種靈芝酸提取及分析方法
【專利說明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明及靈芝酸分析方法技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種靈芝酸提取及分析方法。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004] 靈芝（Ganoderma Iucidum)又稱為仙草、瑞草、神芝、不老草，屬擔(dān)子菌綱、傘菌目、 多孔菌科、靈芝屬真菌，在中國主要指包括赤芝、紫芝以及松杉靈芝等在內(nèi)的芝類，是一種 深受中國人民喜愛的中藥材，也是韓國、日本、泰國等東方國家的傳統(tǒng)珍貴中藥，具有2000 多年的藥用歷史，主要用于肝炎、高血壓、高血脂和胃癌等疾病的治療。靈芝性溫、味甘、微 苦，有益心氣、生血、助心安神、益肺氣、堅(jiān)筋骨、利關(guān)節(jié)、安神補(bǔ)肝等多種功能。食用靈芝可 延年益壽、增強(qiáng)體格。
[0005] 靈芝含有豐富的活性成分，以多糖和屬三萜類的靈芝酸為主要活性成分。藥理研 究顯示靈芝多糖具有抗癌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗氧化等作用；靈芝酸可抑制腫瘤細(xì) 胞、艾滋病毒以及細(xì)菌。當(dāng)前靈芝多糖等靈芝活性物質(zhì)生產(chǎn)主要依賴人工栽培子實(shí)體為原 料以提取的方法獲取，具有產(chǎn)率低、難以規(guī)?；a(chǎn)以及不同批次間活性成分組成及含量 有車父大差異等缺點(diǎn)。
[0006] 靈芝液體深層發(fā)酵具有周期短以及可工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，另外研究表明發(fā)酵產(chǎn)物 靈芝多糖和三萜具有與子實(shí)體相近的抗腫瘤活性，因此，以靈芝多糖、靈芝酸和三萜為目標(biāo) 產(chǎn)物的液體深層發(fā)酵成為靈芝研究熱點(diǎn)。余素萍等研究發(fā)現(xiàn)先搖床培養(yǎng)后靜置培養(yǎng)的方法 有利于菌絲總?cè)坪铣?，有效抗腫瘤三萜生產(chǎn)則以搖床培養(yǎng)為最佳方式。高興喜等發(fā)現(xiàn)真 菌激發(fā)子可誘導(dǎo)靈芝三萜和多糖大量合成。Liu等發(fā)現(xiàn)藥用昆蟲提取物可促進(jìn)靈芝多糖生 物合成。Fang等采用先搖床培養(yǎng)后靜置培養(yǎng)的發(fā)酵工藝可顯著提高靈芝酸產(chǎn)量。
[0007] 靈芝酸是一類高度氧化的羊毛留烷衍生物，主要有高效液相色譜法、香草醛-高 氯酸比色法和紫外吸收法等3種分析方法。高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)在于其可同時(shí)分析不同 單體靈芝酸含量以及樣品制備過程相對(duì)簡單，但儀器昂貴、不易操作以及試劑要求高；紫外 吸收法和香草醛-高氯酸比色法由于所需儀器設(shè)備簡單成為靈芝酸分析的主要方法。紫外 吸收法通常以靈芝酸A和百里酚為靈芝酸對(duì)照品以定量分析；香草醛-高氯酸比色法主要 以熊果酸和齊墩果酸作為參比物進(jìn)行分析。但是利用紫外可見光譜分析不同靈芝酸及對(duì)照 品差異，以不同對(duì)照品利用紫外吸收法和香草醛-高氯酸比色法分析靈芝發(fā)酵菌絲及子實(shí) 體靈芝酸含量，是沒有的。
[0008]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題為提供一種分析簡單、快速、準(zhǔn)確的靈芝酸提取及分 析方法。
[0010] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為： 一種靈芝酸提取及分析方法，包括以下步驟： 步驟一、將靈芝菌株接種至PDA斜面25°C活化培養(yǎng)7天作為瓊脂培養(yǎng)基菌種；取5粒 黃豆粒大小的瓊脂培養(yǎng)基菌種加入至80mL發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行30°C、160r/min恒溫?fù)u瓶培 養(yǎng)5天作為種子；取8mL種子加入至80mL發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行30°C、160r/min丨旦溫?fù)u瓶培養(yǎng) 7天作為發(fā)酵液； 步驟二、取發(fā)酵液40mL裝于50mL離心管進(jìn)行4500r/min離心10min，除去上清，將沉淀 的菌絲用去離子水洗去培養(yǎng)基，將菌絲進(jìn)行離心收集，重復(fù)一次菌絲用去離子水洗及離心 收集的過程；將收集好的菌絲放置在恒重的稱量紙上，用60°C烘至恒重； 步驟三、將烘干后的菌絲于研缽中研為粉末，將粉末進(jìn)行靈芝酸的提取制成菌絲靈芝 酸提取液；取靈芝子實(shí)體切片用中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，將粉碎后的靈芝子實(shí)體切片制成靈 芝子實(shí)體靈芝酸提取液； 步驟四、將菌絲靈芝酸提取液稀釋1倍，和標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸A、標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸C、標(biāo)準(zhǔn)品靈 芝酸C2、標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸E、標(biāo)準(zhǔn)品赤芝酸A、百里酚標(biāo)準(zhǔn)溶液以及靈芝子實(shí)體靈芝酸提取液 分別進(jìn)行紫外可見光譜掃描，得到紫外可見光譜曲線圖； 步驟五、根據(jù)紫外可見光譜曲線圖，標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸A和百里酚標(biāo)準(zhǔn)溶液為對(duì)照品，用紫 外吸收法分別計(jì)算菌絲靈芝酸提取液和靈芝子實(shí)體靈芝酸提取液中靈芝酸的含量。
[0011] 本發(fā)明有益效果是：通過改進(jìn)靈芝酸提取工藝提高其純度提高對(duì)靈芝酸含量分析 方法的準(zhǔn)確性，為優(yōu)化靈芝酸含量分析提供有效方法，提供更好的指導(dǎo)生產(chǎn)以及提高監(jiān)管 水平，使靈芝酸提取工藝更簡單、快速和準(zhǔn)確，有效優(yōu)化和改變靈芝酸分析方法。
[0012] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選結(jié)構(gòu)，在所述步驟一之前還包括： 將葡萄糖35g、蛋白胨3.5g、KH2P04 lg、MgS04 0.5g以及維生素 Bl 0.01 g加入1000 mL 去離子水中，用121°C滅菌20min制成發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0013] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選結(jié)構(gòu)，所述恒溫?fù)u瓶所用的搖瓶均為250mL搖瓶。
[0014] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選結(jié)構(gòu)，所述紫外可見光譜掃描的光程為Icm石英比色皿， 紫外可見光譜掃描的掃描范圍為200~700nm，紫外可見光譜掃描的采樣間隔2nm。
[0015] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的另一種技術(shù)方案為： 一種靈芝酸提取及分析方法，包括以下步驟： 步驟一、將靈芝菌株接種至PDA斜面25°C活化培養(yǎng)7天作為瓊脂培養(yǎng)基菌種；取5粒 黃豆粒大小的瓊脂培養(yǎng)基菌種加入至80mL發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行30°C、160r/min恒溫?fù)u瓶培 養(yǎng)5天作為種子；取8mL種子加入至80mL發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行30°C、160r/min丨旦溫?fù)u瓶培養(yǎng) 7天作為發(fā)酵液； 步驟二、取發(fā)酵液40mL裝于50mL離心管進(jìn)行4500r/min離心10min，除去上清，將沉淀 的菌絲用去離子水洗去培養(yǎng)基，將菌絲進(jìn)行離心收集，重復(fù)一次菌絲用去離子水洗及離心 收集的過程；將收集好的菌絲放置在恒重的稱量紙上，用60°C烘至恒重； 步驟三、將烘干后的靈芝于研缽中研為粉末，將粉末進(jìn)行靈芝酸的提取制成靈芝酸提 取液；取靈芝子實(shí)體切片用中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，將粉碎后的靈芝子實(shí)體切片制成靈芝子 實(shí)體靈芝酸提取液； 步驟四、將靈芝酸提取液和標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸A、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液以及 稀釋1倍的靈芝子實(shí)體靈芝酸提取液分別進(jìn)行紫外可見光譜掃描，得到紫外可見光譜曲線 圖； 步驟五、根據(jù)紫外可見光譜曲線圖，取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為對(duì)照品， 用香草醛-高氯酸比色法分別計(jì)算菌絲靈芝酸提取液和靈芝子實(shí)體靈芝酸提取液中靈芝 酸的含量。
[0016] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選結(jié)構(gòu)，在所述步驟一之前還包括： 將葡萄糖35g、蛋白胨3.5g、KH2P04 lg、MgS04 0.5g以及維生素 Bl 0.01 g加入1000 mL 去離子水中，用121°C滅菌20min制成發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0017] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選結(jié)構(gòu)，所述恒溫?fù)u瓶所用的搖瓶均為250mL搖瓶。
[0018] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選結(jié)構(gòu)，所述紫外可見光譜掃描的光程為Icm石英比色皿， 紫外可見光譜掃描的掃描范圍為200~700nm，紫外可見光譜掃描的采樣間隔2nm。
[0019]
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明實(shí)施方式一得到的不同靈芝酸、赤芝酸A、百里酚以及樣品紫外可見 光譜曲線圖； 圖2為本發(fā)明靈芝酸A、熊果酸、齊墩果酸及靈芝菌絲及子實(shí)體提取液香草醛-高氯酸 顯色反應(yīng)紫外可見光譜曲線圖。
[0021]
【具體實(shí)施方式】
[0022] 為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式 并配合附圖詳予說明。
[0023] 定義： 靈芝酸是一種三萜類物質(zhì)，已分離到100多種，如靈芝酸A、B、C、D、E、F、G、I、L、ma、md、 mg等。有些靈